马铃薯“克新13号”的遗传转化方法技术

本发明专利技术属于遗传转化技术领域，涉及马铃薯“克新13号”的遗传转化方法。包括以下步骤：(1)取马铃薯“克新13号”外植体移接至预培养培养基上进行预培养；(2)活化根癌农杆菌EHA105，用MS重悬液稀释菌液浓度到OD

【技术实现步骤摘要】
卡那霉素和190
‑
210mg
·
L
‑1特美汀，pH为5.8
‑
6.0。
[0010]进一步的，步骤(1)中，所述外植体为茎段。
[0011]进一步的，步骤(1)中，所述外植体为微型薯片。
[0012]进一步的，步骤(1)中，所述外植体是经过充分灭菌消毒后的外植体，所述灭菌消毒的步骤包括用75wt％乙醇溶液洗涤浸泡30s后，再使用8wt％或10wt％NaClO溶液浸泡外植体消毒7或8min，灭菌水洗涤2或3次。
[0013]进一步的，步骤(1)中，预培养培养条件包括光照1500
‑
2500Lx，温度22
‑
26℃；优选为光照2000Lx，温度24℃。
[0014]进一步的，步骤(1)中，预培养培养时间为1
‑
3天；优选为2天。
[0015]进一步的，步骤(2)中，菌液浓度OD
600
＝0.3
‑
0.8；优选为菌液浓度OD
600
＝0.5。
[0016]进一步的，步骤(2)中，侵染时间为6
‑
10min；优选为7min。
[0017]进一步的，步骤(2)中，共培养培养条件包括黑暗条件，温度22
‑
26℃；优选为24℃。
[0018]进一步的，步骤(2)中，共培养培养时间为2
‑
4天；优选为3天。
[0019]进一步的，步骤(3)中，诱导培养条件包括光照1500
‑
2500Lx，温度22
‑
26℃；优选为光照2000Lx，温度24℃。
[0020]进一步的，步骤(3)中，诱导培养时间为15
‑
20天；优选为20天。
[0021]进一步的，步骤(4)中，分化培养条件包括光照1500
‑
2500Lx，温度22
‑
26℃；优选为光照2000Lx，温度24℃。
[0022]进一步的，步骤(4)中，分化培养时间为15
‑
20天；优选为20天。
[0023]进一步的，还包括：待步骤(4)中所述的不定芽分化出苗，再移接至生根培养基中诱导生根；所述生根培养基以MS基本培养基为基础，其中包含0.9
‑
1.1mg
·
L
‑1α
‑
萘乙酸、40
‑
60mg
·
L
‑1卡那霉素和190
‑
210mg
·
L
‑1特美汀。
[0024]本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过在共培养前进行预培养，有利于调整外植体的生长状态，使得后续利于农杆菌的侵染，使得细胞处于易整合外源DNA的状态，同时也有利于防止外植体的褐化现象；在共培养培养基上铺加一层高温灭菌的滤纸，避免外植体与培养基直接接触，减缓外植体对营养的获取，从而减缓农杆菌的过度繁殖；通过合理设置农杆菌浓度有效的降低了农杆菌污染的风险，同时获得到了转化培养的幼小植株，并建立稳定高效抗褐化的马铃薯“克新13号”遗传转化体系，获得基因改良的新品种。
附图说明
[0025]图1：农杆菌载体图谱。
[0026]图2：A为对比例2诱导愈伤组织分化照片；B为实施例1诱导愈伤组织分化照片。
[0027]图3：实施例1生根培养结果。
[0028]图4：马铃薯愈伤PCR产物结果。
具体实施方式
[0029]下面结合具体实施方式以及附图，对本专利技术做进一步说明，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]本专利技术提供了一种马铃薯“克新13号”的遗传转化方法，包括以下步骤：
[0031](1)取马铃薯“克新13号”外植体移接至预培养培养基上进行预培养；所述预培养培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9
‑
2.1mg
·
L
‑
1 6
‑
苄氨基腺嘌呤(以下简称6
‑
BA)、0.5
‑
1mg
·
L
‑
1 2,4
‑
二氯苯氧乙酸(以下简称2,4
‑
D)和0.3
‑
0.5mg
·
L
‑1激动素(以下简称KT)，pH为5.8
‑
6.0；
[0032](2)活化根癌农杆菌EHA105，用MS重悬液稀释菌液浓度到OD
600
＝0.3
‑
0.8，获得农杆菌悬浮液，将步骤(1)预培养后的外植体与农杆菌悬浮液充分浸染6
‑
10min后用灭菌水洗涤，吸干水分后移接至铺有一层无菌滤纸的共培养培养基上进行共培养，所述共培养培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9
‑
2.1mg
·
L
‑
1 6
‑
BA、0.5
‑
1mg
·
L
‑
1 2，4
‑
D、0.3
‑
0.5mg
·
L
‑1KT和19
‑
21mg
·
L
‑1乙酰丁香酮(以下简称AS)，pH为5.8
‑
6.0；
[0033](3)将步骤(2)共培养后的外植体移接至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养形成愈伤组织，所述诱导培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9
‑
2.1mg
·
L
‑
1 6
‑
BA、0.5
‑
1mg
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L
‑
1 2，4
‑
D、0.3
‑
0.5mg
·
L
‑1KT、40
‑
60mg
·
L
‑1卡那霉素(以下简称Kan)和190
‑
210mg
·
L
‑1特美汀(以下简称Tim)，pH为5.8
‑
6.0；
[0034](4)将步骤(3)形成愈伤组织的外植体移接至分化培养基中进行愈伤组织的分化培养形成不定芽，所述分化培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9
‑
2.1mg
·
L
‑
1 6
‑
BA、2
‑
4mg
·
L
‑1KT、0.4
‑
0.6mg
·
L
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.马铃薯“克新13号”的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取马铃薯“克新13号”外植体移接至预培养培养基上进行预培养；所述预培养培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9
‑
2.1mg
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L
‑
1 6
‑
苄氨基腺嘌呤、0.5
‑
1mg
·
L
‑
1 2,4
‑
二氯苯氧乙酸和0.3
‑
0.5mg
·
L
‑1激动素，pH为5.8
‑
6.0；(2)活化根癌农杆菌EHA105，用MS重悬液稀释菌液浓度到OD
600
＝0.3
‑
0.8，获得农杆菌悬浮液，将步骤(1)预培养后的外植体与农杆菌悬浮液充分浸染6
‑
10min后用灭菌水洗涤，吸干水分后移接至铺有一层无菌滤纸的共培养培养基上进行共培养，所述共培养培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9
‑
2.1mg
·
L
‑
1 6
‑
苄氨基腺嘌呤、0.5
‑
1mg
·
L
‑
1 2,4
‑
二氯苯氧乙酸、0.3
‑
0.5mg
·
L
‑1激动素和19
‑
21mg
·
L
‑1乙酰丁香酮，pH为5.8
‑
6.0；(3)将步骤(2)共培养后的外植体移接至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养形成愈伤组织，所述诱导培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9
‑
2.1mg
·
L
‑
1 6
‑
苄氨基腺嘌呤、0.5
‑
1mg
·
L
‑
1 2,4
‑
二氯苯氧乙酸、0.3
‑
0.5mg
·
L
‑1激动素、40
‑
60mg
·
L
‑1卡那霉素和190
‑
210mg
·
L
‑1特美汀，pH为5.8
‑
6.0；(4)将步骤(3)形成愈伤组织的外植体移接至分化培养基中进行愈伤组织的分化培养形成不定芽，所述分化培养基以MS基本培养基为基础，其中包含1.9
‑
2.1mg
·
L
‑
1 6
‑
苄氨基腺嘌呤、2
‑
4mg
·
L
‑1激动素、0.4
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：陈兆贵，李希陶，马文科，林燕文，林静文，雷佳，
申请(专利权)人：惠州学院，
类型：发明
国别省市：