一种谷胱甘肽双功能合成酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种谷胱甘肽双功能合成酶突变体，属于生物技术领域。所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体选自如下任一种：其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示序列突变获得，所述突变为选自如下一个或多个氨基酸残基位点发生突变：14位、47位、49位、92位、107位、113位、136位、206位、230位、250位、251位、258位、269位、313位、345位、363位、373位、414位、416位、510位、531位。本申请通过对双功能谷胱甘肽合成酶StGshF的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)进行定点突变，获得的单突变体，以及两个位点突变获得的双突变体，其酶活和热稳定性相较于野生型均具有显著提升。本申请提供的酶突变体，在生产谷胱甘肽以及构建生产谷胱甘肽的基因工程微生物中具有广阔的应用前景。有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种谷胱甘肽双功能合成酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种热稳定性和/或酶活提高的谷胱甘肽双功能合成酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]在许多真核生物和在革兰氏阴性细菌中，谷胱甘肽的合成是由γ
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谷氨酰半胱氨酸合成酶(简称为γ
‑
GCS或GSH I)和谷胱甘肽合成酶(简称为GS或GSH II)共同完成的。而在革兰氏阳性细菌中尚未发现以上两种谷胱甘肽合成酶。直到2005年，研究人员相继在一些革兰氏阳性细菌中发现了一种新型双功能谷胱甘肽合成酶(简称为GshF或γ
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GCS
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GS)，该酶整合了γ
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GCS和GS两种酶的催化活性并定义了谷胱甘肽一步合成的新途径：以谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸为底物，ATP提供能量，合成谷胱甘肽。目前为止，己在李斯特菌、无乳链球菌、巴斯德菌、嗜热链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、血链球菌、蜡样芽孢杆菌等革兰氏阳性细菌中发现了双功能谷胱甘肽合成酶。
[0003]近年来，GshF被广泛用来异源表达，通过发酵法或者体外酶催化法生产谷胱甘肽GSH。Wang等人通过不同载体系统在大肠杆菌中对嗜热链球菌来源的GshF进行表达，在分批补料发酵中，GSH产量可积累到15.21g/L。Cao等人用大肠杆菌表达无乳链球菌来源的GshF，利用体外酶法催化生产GSH，通过优化催化条件和联合多聚磷酸激酶使GSH产量达到12.32g/L。Cui等人通过酶分子改造提高了GshF的稳定性和活性，再联合多聚磷酸激酶使催化体系中GSH产量达到30.71g/L。专利CN116042545A提供了一种酶活性提高的谷胱甘肽双功能合成酶突变体S722A及其应用，对谷胱甘肽双功能合成酶722位点进行定点突变，得到了酶活提高的突变体S722A，其相对酶活较亲本提高了48.93％，谷胱甘肽产量为20.1mmol/L，WT为16.57mmol/L，产量提高了21.46％。
[0004]GshF在GSH生物法合成领域具有广阔前景，但是由于酶的稳定性限制，如血链球菌和嗜热链球菌来源的GshF在45℃时的半衰期仅为10.61分钟和0分钟，而且GshF的活力较低，酶比活力在0.1
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10U/mg之间，造成酶的添加量高，使用成本高，限制了酶法在工业上的大规模应用。

技术实现思路

[0005]针对目前谷胱甘肽双功能合成酶(GshF)的热稳定性不好和活性较差的问题，本申请通过对双功能谷胱甘肽合成酶基因进行DNA重组以及定点突变和多点突变，使其在提高酶热稳定性的同时还能够保持其优异的催化性能，能够满足工业化生产的需求。
[0006]一方面，本申请提供了一种谷胱甘肽双功能合成酶突变体，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体选自如下任一种：
[0007](a)其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示序列突变获得，所述突变为选自如下一个或多个氨基酸残基位点发生突变：14位、47位、49位、92位、107位、113位、136位、206位、230位、250位、251位、258位、269位、313位、345位、363位、373位、414位、416位、510位、531位；
[0008]或，
[0009](b)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体与(a)所述的如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列同源性，并且具有(a)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的功能，其中对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的14位、47位、49位、92位、107位、113位、136位、206位、230位、250位、251位、258位、269位、313位、345位、363位、373位、414位、416位、510位、531位氨基酸残基与(a)所述的氨基酸序列中的位点相同；
[0010]或，
[0011](c)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体由(a)所述的如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1
‑
30个，优选1
‑
10个，更优选1
‑
6个，更优选1
‑
3个氨基酸残基获得，并且具有(a)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的功能，其中对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的14位、47位、49位、92位、107位、113位、136位、206位、230位、250位、251位、258位、269位、313位、345位、363位、373位、414位、416位、510位、531位氨基酸残基与(a)所述的氨基酸序列中的位点相同。
[0012]在一种实施方式中，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示序列的如下氨基酸残基位点产生的如下突变中的至少一种：
[0013]14位的S突变为M，47位的A突变为P，49位的S突变为P，92位的A突变为P，107位的K突变为P，113位的V突变为I，136位的L突变为K，206位的V突变为P，230位的F突变为Y，258位的A突变为P，269位的S突变为D，345位的K突变为R，414位的T突变为E，416位的H突变为P，510位的G突变为A，531位的F突变为Y。
[0014]在优选的实施方式中，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示序列的如下氨基酸残基位点产生的如下突变中的任意一种或两种：
[0015]14位的S突变为M，47位的A突变为P，49位的S突变为P，92位的A突变为P，107位的K突变为P，113位的V突变为I，136位的L突变为K，206位的V突变为P，230位的F突变为Y，258位的A突变为P，269位的S突变为D，345位的K突变为R，414位的T突变为E，416位的H突变为P，510位的G突变为A，531位的F突变为Y。
[0016]在优选的实施方式中，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示序列的如下氨基酸残基位点产生的如下突变中的任意一种或两种：
[0017]107位的K突变为P，258位的A突变为P，269位的S突变为D，510位的G突变为A，49位的S突变为P。
[0018]在优选的实施方式中，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示序列的如下氨基酸残基位点产生的如下组突变中的任意一组：
[0019]14位的S突变为M，113位的V突变为I；
[0020]92位的A突变为P，345位的K突变为R；
[0021]92位的A突变为P，230位的F突变为Y；
[0022]92位的A突变为P，345位的K突变为R；
[0023]206位的V突变为P，230位的F突变为Y；
[0024]107位的K突变为P，206位的V突变为P；
[0025]136位的L突变为K，531位的F突变为Y；
[0026]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种谷胱甘肽双功能合成酶突变体，其特征在于，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体选自如下任一种：(a)其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示序列突变获得，所述突变为选自如下一个或多个氨基酸残基位点发生突变：14位、47位、49位、92位、107位、113位、136位、206位、230位、250位、251位、258位、269位、313位、345位、363位、373位、414位、416位、510位、531位；或，(b)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体与(a)所述的如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列同源性，并且具有(a)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的功能，其中对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的14位、47位、49位、92位、107位、113位、136位、206位、230位、250位、251位、258位、269位、313位、345位、363位、373位、414位、416位、510位、531位氨基酸残基与(a)所述的氨基酸序列中的位点相同；或，(c)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体由(a)所述的如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1
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30个，优选1
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10个，更优选1
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6个，更优选1
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3个氨基酸残基获得，并且具有(a)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的功能，其中对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的14位、47位、49位、92位、107位、113位、136位、206位、230位、250位、251位、258位、269位、313位、345位、363位、373位、414位、416位、510位、531位氨基酸残基与(a)所述的氨基酸序列中的位点相同。2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽双功能合成酶突变体，其特征在于，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示序列的如下氨基酸残基位点产生的如下突变中的至少一种：14位的S突变为M，47位的A突变为P，49位的S突变为P，92位的A突变为P，107位的K突变为P，113位的V突变为I，136位的L突变为K，206位的V突变为P，230位的F突变为Y，258位的A突变为P，269位的S突变为D，345位的K突变为R，414位的T突变为E，416位的H突变为P，510位的G突变为A，531位的F突变为Y。3.根据权利要求2所述的谷胱甘肽双功能合成酶突变体，其特征在于，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示序列的如下氨基酸残基位点产生的如下突变中的任意一种或两种：14位的S突变为M，47位的A突变为P，49位的S突变为P，92位的A突变为P，107位的K突变为P，113位的V突变为I，136位的L突变为K，206位的V突变为P，230位的F突变为Y，258位的A突变为P，269位的S突变为D，345位的K突变为R，414位的T突变为E，416位的H突变为P，510位的G突变为A，531位的F突变为Y。4.根据权利要求3所述的谷胱甘肽双功能合成酶突变体，其特征在于，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示序列的如下氨基酸残基位点产生的如下组突变中的任意一组：14位的S突变为M，113位的V突变为I；92...

【专利技术属性】
技术研发人员：周伟，段子红，张欣玉，李小燕，
申请(专利权)人：华熙生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：