本发明专利技术提出了一条适于产业化纯化卡贝缩宫素（Ｃａｒｂｅｔｏｃｉｎ）的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化卡贝缩宫素，纯度高且收率好，达到产业化要求。卡贝缩宫素粗肽溶液用反相色谱柱填充材料为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为Ａ相、乙腈为Ｂ相，进行梯度洗脱纯化，其中：梯度：Ｂ％：２０－４０％，Ａ相的ｐＨ为２．５－３．５；采用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐。本发明专利技术采用一步反相高效液相色谱法纯化，接一步阴离子交换柱转盐，高收率得到高纯度醋酸卡贝缩宫素，为大量纯化制备该多肽原料药提供了一种有效纯化工艺。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及卡贝缩宫素纯化的方法。
技术介绍
卡贝缩宫素(Carbetocin)是一种合成的具有激动剂性质的长效催产 素九肽类似物。硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以 预防子宫张力不足和产后出血。卡贝缩宫素的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。^f象催产素一 样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩， 在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子 宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩 宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有 效的子宫收缩作用。不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后，子宫迅速收缩，可在2 分钟内达到一个明确强度。单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用 可持续大约l个小时，因此足以预防刚生产后的产后出血。产后给予卡贝 缩宫素后，在收缩的频率与幅度方面都比催产素要长，并且对有出血倾向、 需额外使用缩宫素者，卡贝缩宫素耐受性好，与缩宫素一样有效甚至更有 效。目前临床常用的促进子宫缩收药物麦角新碱，会导致恶心、呕吐、高 血压和冠脉痉挛等。卡贝缩宫素是一种长效的类催产素药物。与麦角新碱 相比，使用卡贝缩宫素在预防阴道分娩妇女的产后出血方面同样有效，并 且恶心、呕吐、高血压的发生比例显著降低。因此卡贝缩宫素在临床上有很好的应用前景，具有4艮高的开发价值。 目前，还没有文献具体研究卡贝缩宫素相关纯化的方法，特别是纯化 的规模化方法，本专利技术不仅能得到HPLC纯度大于98%的精肽，而且能够规 模化生产，达到纯度高、收率高、产业化的要求。
技术实现思路
本专利技术提出了一条适于产业化纯化卡贝缩宫素的工艺方法，使用反相 高效液相色谱法纯化纯卡贝缩宫素，纯度高且收率好，达到产业化要求。为实现上述目的，本专利技术的技术方案包括以下步骤a、 卡贝缩宫素粗肽溶液用反相色谱柱为固定相，以磷酸盐緩冲溶液为 A相、乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，其中梯度B%: 20-40%， A相 的pH为2. 5-3. 5;b、 釆用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐。 所述的反相色i普柱为采用了反相色谱填充材料的色谱柱。具体实施例方式样品处理卡贝缩宫素粗肽溶液配制成300-500mg/mL,用滤膜过滤后 收集滤液备用。所述卡贝缩宫素粗肽可以是纯度不符合药用标准、或者纯 度不符合工业应用目的或者为通过固相合成法获得而未经纯化的卡贝缩宫素。纯化纯化条件 色谱柱使用反相色谱柱为固定相的色谱柱，优选十八烷基硅烷键合硅胶为填 充材料的色谱柱。色谱柱直径和长度为15 cm x 25cm , 30cm x 25 cm ， 或5 cm x 25 cm 。流动相A相使用磷酸二氢钠和磷酸的緩冲溶液，pH为2.5-3.5,优选pH为 2.8-3.3。配制方法緩冲溶液采用磷酸二氲钠水溶液用磷酸溶液调至需要 的pH，磷酸优选分析纯的磷酸。B相乙腈，优选色谱纯乙腈。流速为450-550 ml/min, 20000-2200 ml/min。,或60-80 ml/min。检测波长230 nm。梯度B%: 20%—40%,优 选24%~38°/ 。进样量为l-70g ,优选进样量为1. 5-2g 、10-15g或50-65 g 。纯化过程将色语柱用50°/ 以上的乙腈沖洗干净后上样，线性梯度洗脱 50-85min，优选56-64min， 60-80 min,或者56-64min。收集目的峰，将 收集的目的肽溶液于水温不超过32。C下减压旋蒸浓缩后备用。3、转盐纯化条件色谱柱填料为阴离子交换树脂所述阴离子交换树脂为提供醋酸根的阴离子交换树脂，优选Amber lite IRA-93或Wofatit AD—41。色i普4主直径和长度为15 cm x 45 cm , 30 cm x 70 Cm或5 cm x 25 cm 。流动相醋酸水溶液，重量百分比浓度为G. 1-0. 5%,优选 为0. 2-0. 3%。流速50-850 ml/min ,优选50-60 ml/min 、 150-170 ml/min 或者750-850 ml/min。；险测波长280 nm。进样量为进样量为1-70g ,优 选进样量为1. 5-2 g 、 10-15g或50-65 g 。转盐过程将色谱柱用去离子水平衡后上样。醋酸水溶液洗脱50-160 min,收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32。C下减压旋蒸浓 縮。后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98%的符合标 准的卡贝缩宫素，纯化收率达70-76%。下面为具体实施方法实施例一1、 样品处理固相合成所得卡贝缩宫素(Carbetocin)粗肽用注射用 水溶解成500mg/mL,用0=0. 45 n m滤膜过滤后收集滤液备用。2、 纯化纯化条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子 直径和长度为5 cm x 25 cm 。流动相A相》粦酸二氢钠水:容液用 分析纯的磷酸调pH至2. 8-3. 3 ; B相色谱纯乙腈。流速60-80 ml/min。 检测波长230 nm。梯度B°/。 24°/。~38°/。 56-64 min。进样量为1. 5-2 g 。纯化过程将色谙柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为 30-40ml样品溶液。线性梯度洗脱56-64min,收集目的峰，将收集的目的 肽溶液于水温不超过32 。C下减压旋蒸浓缩至约50-100 ml/g后备用。3、 转盐色谱柱i真料为阴离子交换树脂Amberlite IRA-93,柱子直 径和长度为5 cm x 25 cm 。流动相0.2-0.3%醋酸水溶液。流速 50—60 ml/min。才企测波长280 nm。进才羊量为1. 5—2. 0g 。转盐过程将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为20-30ml样品 溶液。0.2-0.3%醋酸水溶液洗脱50min,收集目的峰，将收集的目的肽溶 液合并于水温不超过32。C下减压旋蒸浓缩至约4-6 g/ml后转至合适大小 西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98%的符合标准的卡贝缩宫素，纯 化收率达75. 3°/。。实施例二1、样品处理相合成所得卡贝缩宫素(Carbetocin)粗肽用注射用水溶解500mg/mL,用0=0. 45 ju m滤膜过滤后收集滤液备用。2、 纯化纯化条件色镨柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色镨柱，柱 子直径和长度为15 cm x 25 cm 。流动相A相石舞酸二氢钠水溶液 用分析纯的磷酸溶液调pH至2. 8-3. 3 ; B相色谱纯乙腈。流速450-550 ml/min。才企测波长230 nm。梯度B%: 24 % ~ 38% 56-64 min。进样量 为10-15g 。纯化过程将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为 200ml-300ml样品溶液。线性梯度洗脱56-64min，收集目的峰，将收集的 目的肽溶液于水温不超过32t:下减压旋蒸浓缩至约80-200 ml/g后备用。3、 转盐纯化条件色i普柱填料为阴离子交换树脂AmberlUe IRA-93， 柱子直径和长度为15 cm x 45cm。流动相0. 2-0. 3%醋酸水溶液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纯化卡贝缩宫素的方法，包括以下步骤： ａ、卡贝缩宫素粗肽溶液用反相色谱柱为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为Ａ相、乙腈为Ｂ相，进行梯度洗脱纯化，其中：梯度：Ｂ％：２０－４０％，Ａ相的ｐＨ为２．５－３．５； ｂ、采用阴离子交换法将磷酸 盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程生强，覃亮政，马亚平，袁建成，
申请(专利权)人：深圳市翰宇药业有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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