控制碱性磷酸酶制造期间的总唾液酸含量(TSAC)的方法技术

特征在于制造重组碱性磷酸酶，诸如阿斯福酶α的方法，这些方法通过在发酵期间测量总唾液酸含量(TSAC)浓度并相应地调整下游生产步骤来提供对于TSAC浓度的更精确的质量控制。骤来提供对于TSAC浓度的更精确的质量控制。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】控制碱性磷酸酶制造期间的总唾液酸含量(TSAC)的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年10月23日提交的美国临时申请号63/105,052的权益，该临时申请的内容通过援引以其全文并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请含有按ASCII格式以电子方式递交并特此通过援引以其全文并入的序列表。所述ASCII副本创建于2021年10月19日，命名为0608WO_SL.txt，并且大小为15,286字节。

技术介绍

[0005]低磷酸酯酶症(HPP)是一种危及生命的遗传性和超罕见的代谢障碍，其导致无法产生功能性组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)。它导致未矿化骨基质的积累(例如，佝偻病、骨软化症)，其特征在于骨骼和牙齿的低矿化。当生长的骨骼不能适当矿化时，生长障碍会使关节和骨骼的外形损毁。这个结果进而会影响运动性能、呼吸功能，并且甚至可能导致死亡。HPP包括围产期、婴儿期、青少年(或儿童期)和成人HPP。在历史上，定义了六种临床形式，大多数是基于症状发作时的年龄，包括围产期、良性产前、婴儿期、青少年、成人和牙HPP。
[0006]阿斯福酶α(亚力兄制药公司(Alexion Pharmaceuticals，Inc.))是一种经过批准的同类首创的靶向酶替代疗法，其被设计来解决有缺陷的内源性TNSALP水平。阿斯福酶α是一种可溶性融合糖蛋白，包含人TNSALP的催化结构域、人免疫球蛋白G1 Fc结构域和用作骨靶向结构域的德卡
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天冬氨酸肽(例如，D10)(SEQ ID NO:2)。在体外，与缺乏德卡
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天冬氨酸肽的可溶性TNSALP相比，阿斯福酶α以更大的亲和力与羟基磷灰石结合，从而允许阿斯福酶α的TNSALP部分有效地降解过量的局部无机焦磷酸盐(PPi)并恢复骨骼的正常矿化。焦磷酸盐水解促进骨骼矿化，并且其效果在非临床研究中评价的物种中相似。
[0007]阿斯福酶α是一种真核蛋白，其含有翻译后修饰，例如糖基化(例如，唾液酸化)。商业规模量的治疗有效碱性磷酸酶(诸如阿斯福酶α)的生产涉及多步骤制造工艺，其条件可能显著影响最终产物。在此工艺中，翻译后修饰的产物可能在制造工艺的一个或多个步骤期间暴露于糖苷酶或其他水解条件，从而对翻译后修饰产生负面影响。例如，添加的唾液酸部分可能丢失。这些变化可能降低大量批次产物的半衰期和酶促活性。因此，需要改进的制造碱性磷酸酶的方法，以改进最终蛋白质产物及其糖基化特征的质量控制。

技术实现思路

[0008]本文披露了可以用于改进碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)的生产中糖基化的质量控制的制造工艺。这些方法还可以用于维持、保护、调节和/或改善酶促活性，并且特别地维持、控制和/或提高通过培养的哺乳动物细胞，特别地通过培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的重组蛋白，诸如碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)的半衰期。此类碱性磷酸酶(例如，阿斯福酶α)适用于在疗法中使用，例如用于治疗受试者，例如人受试者的与降低的碱性磷酸
酶蛋白水平(例如，HPP)和/或功能(例如，无机焦磷酸盐(PPi)的裂解不足等)相关联的病症。
[0009]在一方面，特征在于一种产生重组碱性磷酸酶的方法。该方法包括以下步骤：用表达重组碱性磷酸酶的细胞(例如，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)接种生物反应器；获得包含该重组碱性磷酸酶的水性培养基；在接种之后约第6天至约第10天，特别地约第6天至约第8天(例如，约第6天、约第7天、约第8天、约第9天、约第10天，例如约第7天)从该水性培养基中获得等分试样；定量该等分试样中每摩尔该重组碱性磷酸酶的总唾液酸含量(TSAC)摩尔浓度；收获该水性培养基；以及进行过滤步骤(例如，超滤、渗滤或其组合)；最终获得原料药(BDS)。该方法可以进一步包括在过滤步骤与获得该BDS之间的额外下游纯化步骤(图1)。
[0010]来自该发酵阶段的该培养基的等分试样用于确定保持过滤池期间的时间量。例如，如果该等分试样具有小于约2.5mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持小于约9小时。如果该等分试样具有约2.5mol/mol至约2.7mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约10小时至约14小时。如果该等分试样具有约2.8mol/mol至约3.0mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约23小时至约27小时。如果该等分试样具有大于约3.0mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约38小时至约42小时。
[0011]在一个实施例中，如果该等分试样具有小于约2.5mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约7+/
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2小时或更少时间(例如，在约5
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9小时之间)。如果该等分试样具有约2.5mol/mol至约2.7mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约18+/
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2小时或更少时间(例如，在约16
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20小时之间)。如果该等分试样具有大于约2.7mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约32+/
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2小时或更少时间(例如，在约30
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34小时之间)。
[0012]在另一个实施例中，如果该等分试样具有小于或等于约2.3mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约18+/
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4小时或更少时间(例如，在约14
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22小时之间)。如果该等分试样具有大于约2.3mol/mol至约3.1mol/mol(例如，约2.4mol/mol至约3.1mol/mol)的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约32+/
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4小时或更少时间(例如，在约28
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36小时之间)。如果该等分试样具有大于约3.1mol/mol(例如，大于或等于约3.2mol/mol)的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约44+/
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4小时或更少时间(例如，在约40
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48小时之间)。
[0013]在另一个实施例中，如果该等分试样具有小于约2.4mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约17+/
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3小时或更少时间(例如，在约14
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20小时之间)。如果该等分试样具有约2.4mol/mol至约3.6mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约31+/
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3小时或更少时间(例如，在约28
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34小时之间)。如果该等分试样具有大于约3.6mol/mol的TSAC浓度，则过滤步骤可以保持约45+/
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3小时(例如，在约42
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48小时之间)。过滤步骤期间的碱性磷酸酶浓度可以是约3.7+/
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0.4g/L。
[0014]过滤步骤期间的碱性磷酸酶浓度可以是约1.8g/L至约5.0g/L(例如，约1.8至约4.3g/L，例如约2.3g/L、约3.1g本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生重组碱性磷酸酶的方法，该方法包括：(a)用表达重组碱性磷酸酶的细胞接种生物反应器；(b)获得包含该重组碱性磷酸酶的水性培养基；(c)在接种之后约第6天至约第10天从该水性培养基中获得等分试样；(d)定量该等分试样中每摩尔该重组碱性磷酸酶的总唾液酸含量(TSAC)摩尔浓度；(e)收获该水性培养基；以及(f)进行至少一个纯化步骤以获得原料药溶液(BDS)；其中：(i)(1)该等分试样具有小于约2.5mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持小于约9小时；(2)该等分试样具有约2.5mol/mol至约2.7mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约10小时至约14小时；(3)该等分试样具有约2.8mol/mol至约3.0mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约23小时至约27小时；或者(4)该等分试样具有大于约3.0mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约38小时至约42小时；或者(ii)(1)该等分试样具有小于约2.5mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约5小时至约9小时；(2)该等分试样具有约2.5mol/mol至约2.7mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约16小时至约20小时；或者(3)该等分试样具有大于约2.7mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约30小时至约34小时；或者(iii)(1)该等分试样具有小于或等于约2.3mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约14小时至约22小时；(2)该等分试样具有约2.4mol/mol至约3.1mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约28小时至约36小时；或者(3)该等分试样具有大于或等于约3.2mol/mol的TSAC浓度，并且过滤步骤保持约40小时至约48小时。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括在接种之后约第7天从该水性培养基中获得该等分试样。3.如权利要求1或2所述的方法，其中该过滤步骤包括超滤、渗滤或其组合。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该细胞是哺乳动物细胞。5.如权利要求4所述的方法，其中该哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该等分试样的TSAC浓度小于约2.5mol/mol，并且该过滤步骤保持小于约9小时。7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该等分试样的TSAC浓度是约2.5mol/mol至约2.7mol/mol，并且该过滤步骤保持约10小时至约14小时。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该过滤步骤期间的该碱性磷酸酶浓度是约1.8g/L至约5.0g/L。9.如权利要求8所述的方法，其中该过滤步骤期间的该碱性磷酸酶浓度是约1.8至约4.3g/L。10.如权利要求9所述的方法，其中该过滤步骤期间的该碱性磷酸酶浓度是约2.3g/L、约3.1g/L或约3.7g/L。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该BDS的TSAC浓度是约1.2mol/mol至约3.0mol/mol。12.如权利要求11所述的方法，其中该BDS的TSAC浓度是约1.6mol/mol至约2.4mol/mol。13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中该过滤步骤保持在恒定温度下。14.如权利要求13所述的方法，其中该恒定温度是约15℃至约2...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅根，
申请(专利权)人：阿雷克森制药公司，
类型：发明
国别省市：