一种纯化微生物的方法及其试剂盒技术

一种纯化微生物的方法及其试剂盒，纯化微生物的方法，包括：酶处理步骤，包括提供微生物，使用酶对微生物进行处理，得到处理液；纯化步骤，包括对处理液进行纯化，得到纯化后的液体；浓缩步骤，包括对纯化后的液体进行浓缩，然后离心，收集沉淀，得到浓缩后的微生物。加入本发明专利技术纯化的内标后，在样本中能有效检出目标微生物(例如噬菌体)，且不会导致非目标微生物(例如大肠埃希菌)检出。(例如大肠埃希菌)检出。(例如大肠埃希菌)检出。

【技术实现步骤摘要】
一种纯化微生物的方法及其试剂盒


[0001]本专利技术涉及微生物检测
，具体涉及一种纯化微生物的方法及其试剂盒。

技术介绍

[0002]相比于常规的微生物检测方法，高通量测序技术可以更快捷、更精确地鉴定微生物物种，因此，该技术正逐渐被广泛应用于微生物检测领域，尤其是对于背景情况未知的样品。基于检测目的不同，通常区分为检测DNA和检测RNA两种。
[0003]但是由于该技术具有流程长，操作复杂等特性，需要设置严格的质量控制体系来确保检测结果的真实可靠。其中内标质控是公认的，质量体系的重要组成部分。根据核酸检测的普遍共识和实践基础，在检测样本引入高特异性外源核酸，是常见的内标设置方法之一。检测DNA时加入外源DNA，检测RNA时加入外源RNA。
[0004]由于RNA天然结构稳定性较差，纯化的RNA片段存在降解的风险。在优化为产品的过程中存在诸多困难。而选择天然存在的RNA病毒，可以相对提高稳定性。但同时，应用于高通量测序技术时，需要避免序列不够特异，或者存在宿主基因组污染的问题。简单的培养病毒，无法解决这些问题。
[0005]现有技术存在的缺陷包括：
[0006]1)使用DNA作为内标，可能是纯化过的片段或者质粒，不是RNA，不能有效质控流程中RNA特有的反应，比如反转录。
[0007]2)使用RNA作为内标。一般是纯化后的核酸。可能是体外转录获得，也可能是通过核酸提取获得。一般会配合特殊的储存溶液，并要求超低温储存。缺点是稳定性差，储存困难，体现形式包括：要求
‑
80℃储存，试剂盒效期短(6个月甚至更短)，使用时需要额外注意等。
[0008]3)使用简单纯化的噬菌体，只是对噬菌体进行了初步的纯化，没有完全去除其宿主菌(大肠埃希菌)的核酸。这种内标只能用于荧光PCR或等温扩增等产品。因为这一类产品的靶标都是一个或几个。只要预期用途不涉及检测大肠埃希菌，则不会有影响。但对于宏基因组学检测，如果使用该产品，结果中会出现大量大肠埃希菌，无法判断是内标引入还是样本本身包含。因此，缺点是有大肠埃希菌的核酸存在，对检测造成干扰。该方法只能用于荧光PCR等方法的内标，不能用于高通量测序产品。如果用于高通量测序，由于没有经过精制纯化，会有大量大肠埃希菌检出。
[0009]综上，急需可以用于高通量测序微生物检测的RNA病毒内标生产方法。

技术实现思路

[0010]根据第一方面，在一实施例中，提供一种纯化微生物的方法，包括：
[0011]酶处理步骤，包括提供微生物，使用酶对微生物进行处理，得到处理液；
[0012]纯化步骤，包括对处理液进行纯化，得到纯化后的液体；
[0013]浓缩步骤，包括对纯化后的液体进行浓缩，然后离心，收集沉淀，得到浓缩后的微
生物。
[0014]根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面所述方法纯化得到的微生物。
[0015]根据第三方面，在一实施例中，提供一种内标质控品，所述内标质控品包含第二方面所述微生物。
[0016]根据第四方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第二方面所述微生物，或第三方面所述内标质控品。
[0017]根据第五方面，在一实施例中，提供一种检测微生物的方法，包括：
[0018]混合步骤，包括将待测样本与第二方面所述微生物混合，得到混合样本；
[0019]检测步骤，包括对所述混合样本提取核酸，从提取的核酸中检测目标微生物。
[0020]依据上述实施例的一种纯化微生物的方法及其试剂盒，加入本专利技术纯化的内标后，在样本中能有效检出目标微生物(例如噬菌体)，且不会导致非目标微生物(例如大肠埃希菌)检出。
附图说明
[0021]图1为一种实施例中生产噬菌体的流程图。
[0022]图2为一种实施例中将噬菌体作为NGS内标的应用流程示意图。
[0023]图3为一种实施例中将噬菌体作为NGS内标应用后的检测结果图。
[0024]图4为MS2在4℃存储不同时间后的稳定性测试结果。
具体实施方式
[0025]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0026]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0027]本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
[0028]根据第一方面，在一实施例中，提供一种纯化微生物的方法，包括：
[0029]酶处理步骤，包括提供微生物，使用酶对微生物进行处理，得到处理液；
[0030]纯化步骤，包括对处理液进行纯化，得到纯化后的液体；
[0031]浓缩步骤，包括对纯化后的液体进行浓缩，然后离心，收集沉淀，得到浓缩后的微生物。
[0032]在一实施例中，该方法处理得到的微生物(通常可以是专性的、不能引起人或动物
感染的RNA病毒)可用于潜在存在大肠埃希菌感染的样本检测。
[0033]在一实施例中，将本专利技术纯化的微生物(例如RNA病毒)直接用于mNGS(宏基因组测序)检测病原体的产品中，可检出大肠埃希菌。
[0034]酶处理步骤主要用于初步降解液体中的核酸，纯化步骤主要用于完全去除残留核酸，浓缩步骤主要用于提高噬菌体终浓度，以达到使用要求。
[0035]在一实施例中，所述酶处理步骤中，反应体系中还含有的酶包括但不限于HL
‑
SAN酶、核糖核酸酶A(RNase A)。HL
‑
SAN酶用于去除大肠杆菌的DNA，RNaseA用于去除大肠杆菌的RNA。
[0036]HL
‑
SAN酶是一种耐高盐的工程化内切酶。该酶在0.5M NaCl条件下具有较佳活性，主要用于去除宿主DNA污染。在大肠埃希菌裂解液中可以直接配制反应体系，不需要额外纯化。
[0037]核糖核酸酶A是内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3'端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。
[0038]各厂商的DNase I(脱氧核糖核酸酶I)都可以替代HL...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化微生物的方法，其特征在于，包括：酶处理步骤，包括提供微生物，使用酶对微生物进行处理，得到处理液；纯化步骤，包括对处理液进行纯化，得到纯化后的液体；浓缩步骤，包括对纯化后的液体进行浓缩，然后离心，收集沉淀，得到浓缩后的微生物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶处理步骤中，反应体系中含有的酶包括HL
‑
SAN酶、核糖核酸酶A；优选地，所述酶处理步骤中，反应体系中还含有NaCl、MgCl2；优选地，所述酶处理步骤中，反应温度为37℃，时间为30min～60min；优选地，所述酶处理步骤中，反应体系中含有的酶包括脱氧核糖核酸酶I；优选地，所述酶处理步骤中，反应体系中含有的酶包括全能核酸酶；优选地，所述全能核酸酶包括Benzonase。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化步骤中，所述纯化包括层析柱纯化。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓缩步骤中，使用浓缩试剂对纯化后的液体进行浓缩；优选地，所述浓缩步骤中，收集沉淀后，使用稀释剂对沉淀进行稀释，得到稀释后的液体；优选地，所述浓缩步骤中，所述稀释液包括缓冲液；优选地，所述浓缩步骤中，所述缓冲液包括TE缓冲液；优选地，所述浓缩步骤中，所述稀释后的液体的存储温度为2～8℃；优选地，所述浓缩步骤中，所述微生物为病...

【专利技术属性】
技术研发人员：林永权，马珍子，吴红龙，
申请(专利权)人：天津华大医学检验所有限公司南京华大医学检验所有限公司深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：