一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光（RAA）快速检测的引物探针组合、试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的引物探针组合和试剂盒，可实现39℃条件下20min内完成对虾急性肝胰腺坏死病的检测；与常见的对虾白斑综合征病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒、细菌性肝胰腺坏死病、肝肠胞虫、十足目虹彩病毒I型、副溶血性弧菌均无交叉反应，特异性达100％。检测方法快速、可靠、操作简便，弥补了传统检测技术的不足，可用于现场检测。本发明专利技术提供的基于RAA荧光法快速检测急性肝胰腺坏死病的方法，灵敏度高，达102copies/uL。copies/uL。copies/uL。

【技术实现步骤摘要】
一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的引物探针组合、试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，具体涉及一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的引物探针组合、试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopannecrosis disease,AHPND)是由副溶血性弧菌携带的质粒编码PirAVP和PirBVP毒素基因引起的一种对虾疾病。由于该疫病在早期(投苗30d左右)会引起虾苗不寻常的高死亡率而被称之为早死综合征(EMS)，该病在全球虾类主要养殖地区肆虐，给越南、中国、马来西亚、泰国、墨西哥和菲律宾等国对虾产业带来巨大损失。患病对虾主要临床症状表现为肝胰腺萎缩、颜色变浅，空肠空胃，甲壳变软，失去活力等，常为急性死亡，死亡率高达100％。
[0003]我国水产养殖规模在不断扩大，集约化养殖模式快速发展，水产养殖病害形势变的非常严峻，AHPND作为一种细菌病是当前对虾养殖主要病害之一，但是当前该病主要采用，普通PCR和荧光PCR开展检测，虽然特异性强、灵敏度高，但是仪器昂贵、检测耗时长、需要专门的实验场地、检测人员要求高的问题。在海关快速通关的背景下，快速检测显得尤为重要，RAA恒温荧光检测仅需要20min，该方法可以大大压缩检测时长，因此希望开发一种AHPND的RAA快速检测方法，并且应用于进口亲虾、养殖场现场的AHPND的快速检测中。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种快速检测对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)检测方法，适用于养殖场监控、海关、水产技术推广站等部门，对AHPND病原的检测，用于解决对虾养殖中AHPND流行、传播、预防和控制的问题。
[0005]本专利技术首先提供了一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)引物探针，优选的，所述引物和探针为针对PVA1中的保守序列SEQ ID NO:4设计；
[0006]更优选的，所述上游引物F为SEQ ID NO:1，下游引物R为SEQ ID NO:2，探针P为SEQ ID NO:3。
[0007]优选的，所述的荧光探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基基数27bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团和淬灭基团之间间隔1个碱基，且探针的29位的A用四氢呋喃残基替换。
[0008]更优选的，所述荧光探针的荧光报告基团为FAM；荧光淬灭基团为BHQ1；
[0009]其次，本专利技术提供了一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的试剂盒，所述的检测试剂盒包含所述的引物和探针和其他RAA检测试剂。
[0010]另外，本专利技术提供了一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的方法；
[0011]优选的，所述方法用于非诊断目的，其包括如下步骤：
[0012](1)提取待检测对象的核酸样品。
[0013](2)试剂配制：
[0014]a.向装有干粉酶制剂的检测单元管中先加入25μL A Buffer、2μL上游引物F(10μM)、2μL下游引物R(10μM)，0.6μLP探针(10uM)、12.9uL的水；
[0015]b.再向检测单元管中加入5uL待检DNA核酸；c.在检测单元管盖上加入2.5uL的B Buffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀6次，随后低速离心10sec。
[0016](3)采用ABI荧光PCR仪，对参数进行设置，荧光通道选择FAM通道，淬灭基团为None，反应程序为39℃60sec；39℃30sec，40个循环。
[0017](4)结果判定：
[0018]阳性对照：有典型的扩增曲线出现，出锋时间≤15min，为有效结果；
[0019]阴性对照：无扩增曲线出现，或出锋时间≥20min，为有效结果；
[0020]有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤18min，判定为阳性；
[0021]无明显扩增曲线，出峰时间＞18min，判定为阴性。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下突出优点：AHPND
‑
RAA检测方法操作简便、快速、灵敏度高，仅仅20min就可以出结果，检测限达100copies/μL,相对于传统的荧光PCR、普通PCR而言，大大提高了检测效率，在快速通关的背景下，可高效运用于现场AHPND快速筛查，有效压缩通关时长，对于进出口的AHPND防控具有重大意义。
附图说明
[0023]图1本专利技术引物探针组合筛选结果图。1
‑
9：引物组合1
‑
9；N：阴性对照，P：阳性对照；
[0024]图2PVA1筛选的组合5引物探针与pirA和pirB毒素基因的引物探针序列的比对；5：引物组合5；10：引物组合10；11：引物组合11；P：阳性对照；N：阴性对照；
[0025]图3基于AHPND
‑
RAA检测方法的灵敏性试验结果。
[0026]图4基于AHPND
‑
RAA检测方法特异性试验结果。
具体实施方式
[0027]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0028]以下实施例中所用的材料、试剂等，无特殊说明，均为常规方法。
[0029]以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030]以下实施例中RAA扩增基础试剂盒购自于杭州众测生物科技有限公司。
[0031]以下实施例中引物、探针和质粒均是委托湖州河马生物科技有限公司合成。
[0032]以下实施例中PVA1基因阳性质粒克隆在PUC57载体中。
[0033]实施例1急性肝胰腺坏死病的RAA引物和探针的设计和筛选，试剂盒的建立
[0034]运用DNASTAR软件进行同源性分析和Blast序列分析，筛选出急性肝胰腺坏死病的病原体副溶血性弧菌的质粒PVA1中的保守序列如下SEQ ID NO:4：
[0035]TCATTGAAACAAAAGAAACAAGCGAAACGGATGCCCAAGTCTTTCCTGTAAAATGAATTAGTTAACATATATTGATCATAAAAATGCATTCTTTTTTACAAAGTAACATTTCATTTATGTTTGTTTTCTTATTGATGCAATACG；
[0036]以筛选获得的高度保守序列144bp作为检测目的的基因片段，并进行引物、探针设计筛选检测。
[0037](1)引物和探针设计
[0038]根据PVA1保守序列，上游引物和下游引物、探针序列如下：
[0039]F1：5'
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包含了引物上游F、下游引物R和探针P组成，所述引物和探针为针对PVA1中的保守序列SEQ ID NO:4设计。2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述上游引物F为SEQ ID NO:1，下游引物R为SEQ ID NO:2，探针P为SEQ ID NO:3。3.如权利要求1或2所述探针，其特征在于，所述的荧光探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5，端碱基基数27bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3，端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团和淬灭基团之间间隔1个碱基，且探针的29位的A用四氢呋喃残基替换。4.如权利要求3所述的探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM；荧光淬灭基团为BHQ1。5.一种对虾急性肝胰腺坏死病恒温荧光(RAA)快速检测的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包含权利要求1
‑
4任一项所述的引物和探针和其他RA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李家侨，张娜，谢艳辉，尹伟力，刘骁，刘荭，郑枢，郑晓聪，唐媛媛，斯泽恩，郑舒尹，梁君妮，杨柏，杨金金，
申请(专利权)人：湛江海关技术中心，
类型：发明
国别省市：