一种靶向多肽纳米复合物、其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种靶向多肽纳米复合物、其制备方法和应用。本发明专利技术构建了靶向多肽WIP2W的纳米复合物剂型，应用于白血病细胞模型与慢性髓系白血病小鼠模型的治疗。所述多肽含有WT1靶向拮抗多肽序列与穿膜肽序列，具有高特异性和靶向性。所述纳米复合物包括纳米胶束和脂质体，其中，聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG

【技术实现步骤摘要】
一种靶向多肽纳米复合物、其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种靶向多肽纳米复合物、其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]多肽是由氨基酸通过肽键相连构成的一类化学活性物质，与生理活性分子结构相似度高，具有高选择性与特异性等特点。多肽主要通过蛋白水解和肾过滤清除，安全性较好，与小分子化疗药物和生物制剂相比，具有低副作用和独特的成药优势以及市场价值。同时，多肽存在的主要问题是药物血浆半衰期短，跨越细胞膜效率低，生物利用度有待提高。因此对多肽的结构改造、剂型优化等研究势在必行，具体发展方向有增加细胞穿膜肽序列促进跨膜递送效率、通过生物相容性载体包载多肽来提高其稳定性与增强肿瘤蓄积能力等。
[0003]随着纳米技术的发展，基于聚合物、脂质体和无机材料的纳米药物载体是多肽药物剂型优化的理想候选者。其中，基于聚合物、脂质体的纳米载体具有较好生物相容性和优先聚集在肿瘤组织中的高渗透长滞留效应等优势，有效增强多肽的肿瘤治疗效果与降低对正常组织的毒副作用，提高多肽的生物利用度。聚合物型胶束载体是一类新型药物载体系统，通常用于疏水性药物的溶解性改善或递送。聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(poly(ethylene glycol)
‑
phosphoethanolamine,PEG
2000
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DSPE，以下简称PEG
‑
PE)，是由聚乙二醇和磷脂酰乙醇胺经酰胺键共价连接成一个典型的两亲性聚合物分子。PEG
‑
PE在水中自发地组装形成胶束，PE构成胶束疏水性内核，PEG构成胶束亲水性壳层，通过分子间相互作用负载药物分子。脂质体是将磷脂等类脂质分散于水中所形成的具有双分子层包裹水相结构的封闭小囊泡，是一类安全良好型药物载体。
[0004]近年来，肿瘤相关靶向多肽药物的开发受到广泛的关注。WT1(Wilms Tumor gene
‑
1)编码的转录调控蛋白可调控造血细胞的增殖和分化，在各类白血病如急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)急变期中高度表达，在正常外周血白细胞中表达水平甚低。提示以其为靶点的主动靶向治疗具有广泛的科学意义和潜在临床应用价值。WT1特异性靶向拮抗多肽是一种针对WT1的多肽药物，在慢性髓系白血病细胞及小鼠肿瘤模型上显示出微摩尔级别的细胞毒性和良好的肿瘤治疗潜力。目前尚没有任何一款WT1拮抗药物被成功开发出来用于临床治疗。

技术实现思路

[0005]因此，本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种靶向多肽纳米复合物、其制备方法和应用。本专利技术构建了纳米复合物递送系统，提高WT1靶向多肽在肿瘤中的富集能力与治疗效果，优化多肽的成药性，对白血病靶向治疗药物提供可行性的方法和技术。前期研究筛选得到的靶向拮抗多肽含有WT1靶向拮抗序列与穿膜肽序列，能够针对癌症细胞中高表达的WT1蛋白，干扰其功能，影响细胞存活，但对慢性髓系白血病小鼠模型的抑制效
果有限。聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG
‑
PE)纳米胶束或脂质体可以有效包载靶向拮抗多肽，组装而成的靶向多肽纳米复合物在细胞水平上延长了游离多肽的药效。纳米胶束也在慢性髓系白血病小鼠模型上改善了游离多肽的分布和提高了抗肿瘤效果。
[0006]在阐述本
技术实现思路
之前，定义本文中所使用的术语如下：
[0007]术语“WT1”是指：肾母细胞瘤基因编码的转录因子，具有激活和抑制双重功能，可与各种生长因子等基因启动子结合并调节这些基因转录。
[0008]术语“穿膜肽的序列”是指：氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的多肽序列，为YGRKKRRQRRR，具有穿膜和核定位能力。
[0009]术语“PEG
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PE”是指：聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺胺(poly(ethylene glycol)
‑
phosphoethanolamine,PEG
‑
PE)，是一种两亲性聚合物分子。
[0010]术语“纳米胶束”是指：聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺在水中自发聚集形成的核壳结构，作为载药系统具有生物相容性好、改善药物的体内分布与溶解性等优点。
[0011]术语“脂质体”是指：将磷脂等类脂质分散于水中所形成的具有双分子层包裹水相结构的封闭小囊泡，最早于1965年由Bangham等人提出，是一类安全良好型药物载体。
[0012]术语“WIP2W”是指：一条WT1特异性靶向拮抗多肽，其序列如SEQ ID NO:11所示。
[0013]术语“FITC
‑
WIP2W”是指：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的一条WT1特异性靶向拮抗多肽，其序列如SEQ ID NO:22所示。
[0014]术语“靶向多肽纳米胶束”是指：负载一条WT1特异性靶向拮抗多肽的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺纳米胶束。
[0015]术语“靶向多肽脂质体”是指：负载一条WT1特异性靶向拮抗多肽的纳米脂质体。
[0016]术语“CML”是指：人慢性髓系白血病。
[0017]术语“AML”是指：人急性髓系白血病。
[0018]术语“K562”是指：人慢性髓系白血病细胞，是由Lozzio从一名53岁的慢性髓细胞性白血病急变期的女性患者胸水中分离建立的。
[0019]术语“HL
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60”是指：人急性早幼粒白血病细胞，由CollinsSJ从一位患有急性早幼粒细胞性白血病的36岁白人女性的外周血中分离建立，具有吞噬活性和趋化反应。
[0020]术语“RPMI 1640培养基”是指：洛斯维
·
帕克纪念研究所研发的一类细胞培养基，含有还原剂谷胱甘肽和高浓度的维生素，可用于悬浮和单层培养人类白血病细胞。
[0021]术语“DMEM培养基”是指：一类细胞培养基，高糖，含L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺，不含酚红。
[0022]术语“μM”是指：微摩尔每升(μmol/L),每升体系所含某物质的微摩尔量。
[0023]为实现上述目的，本专利技术的第一方面提供了一种靶向多肽纳米复合物，所述靶向多肽纳米复合物通过特异性靶向拮抗多肽与(1)纳米胶束或(2)脂质体组装而成且所述靶向多肽纳米复合物优选为溶液形式；其中，所述特异性靶向拮抗多肽包含WT1靶向拮抗多肽和穿膜肽，并与癌症细胞的WT1蛋白结合；且所述特异性靶向拮抗多肽选自以下一种或多种：以极性氨基酸为主的多肽、以疏水氨基酸为主的多肽、兼有极性氨基酸和疏水性氨基酸的多肽；
[0024]优选地，所述WT1靶向拮抗多肽为无任何荧光分子标记的WT1靶向拮抗多肽，更优选为探针、纳米材料或生物素标记的WT1靶向拮抗多肽；
[0025]进一步优选地，所述探针选自以下一种或多种：荧光探针、量子点、放射性元素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，更进一步优选为荧光探针或量子点；所述纳米材料选自以下一种或多种：纳米颗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向多肽纳米复合物，其特征在于，所述靶向多肽纳米复合物通过特异性靶向拮抗多肽与(1)纳米胶束或(2)脂质体组装而成且所述靶向多肽纳米复合物优选为溶液形式；其中，所述特异性靶向拮抗多肽包含WT1靶向拮抗多肽和穿膜肽，并与癌症细胞的WT1蛋白结合；且所述特异性靶向拮抗多肽选自以下一种或多种：以极性氨基酸为主的多肽、以疏水氨基酸为主的多肽、兼有极性氨基酸和疏水性氨基酸的多肽；优选地，所述WT1靶向拮抗多肽为无任何荧光分子标记的WT1靶向拮抗多肽，更优选为探针、纳米材料或生物素标记的WT1靶向拮抗多肽；进一步优选地，所述探针选自以下一种或多种：荧光探针、量子点、放射性元素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，更进一步优选为荧光探针或量子点；所述纳米材料选自以下一种或多种：纳米颗粒、纳米管、纳米线、石墨烯、二维纳米材料、荧光微球；和/或所述生物素为生物素分子。2.根据权利要求1所述的靶向多肽纳米复合物，其特征在于：所述WT1靶向拮抗多肽由5～100个氨基酸组成，优选为由5～50个氨基酸组成，更优选为由10～40个氨基酸组成；优选地，所述WT1靶向拮抗多肽的序列选自以下一种或多种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11；更优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11，进一步优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11；最优选为SEQ ID NO:11；和/或优选地，所述穿膜肽的序列为SEQ ID NO:23。3.根据权利要求1或2所述的靶向多肽纳米复合物，其特征在于：所述荧光探针选自以下一种或多种：FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa Fluro 647，优选选自以下一种或多种：FITC、Cy5、Cy5.5，最优选为FITC；优选地，所述探针、纳米材料或生物素标记的WT1靶向拮抗多肽序列选自以下一种或多种：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22，更优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22，进一步优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；最优选为SEQ ID NO:22。4.根据权利要求1至3中任一项所述的靶向多肽纳米复合物，其特征在于：所述纳米胶束为聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺形成的核壳结构，所述聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺为聚乙二醇亲水嵌段通过共价键和磷脂分子疏水嵌段上的含氮碱基结合形成的化合物，其中，所述聚乙二醇亲水嵌段的分子量优选为500～10000Da，更优选为1000～5000Da，进一步优选为2000～4000Da；和/或所述脂质体通过磷脂和胆固醇形成的磷脂双分子层结构体系，所述脂质体优选选自以下一种或多种：1
‑
肉豆蔻酰基
‑2‑
硬脂酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
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聚乙二醇2000、二硬脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、硬脂酰胺、胆固醇衍生物，更优选选自以下一种或多种：1
‑
肉豆蔻酰基
‑2‑
硬脂酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
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聚乙二醇2000。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的靶向多肽纳米复合物，所述靶向多肽纳米复合物通过特异性靶向拮抗多肽与纳米胶束组装而成，其特征在于：所述靶向多肽纳米复合物的粒径为10～100nm；优选为10～50nm；更优选为10～30nm；所述纳米胶束与所述特异性靶向拮抗多肽的摩尔比为1～50:1～20，优选为1～30:1～10，更优选为1～20:1～5，进一步优选为1～10:1；和/或所述特异性靶向拮抗多肽与所述纳米胶束的结合方式为非共价结合或共价偶联，更优选为非共价结合；优选地，所述特异性靶向拮抗多肽与所述纳米胶束由于静电相互作用将药物载入所述纳米胶束中。6.根据权利要求1至4中任一项所述的靶向多肽纳米复合物，所述靶向多肽纳米复合物通过特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琛，陈梦婷，方小翠，杨延莲，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：