一组含有核糖体结合位点的连接序列及应用制造技术

本发明专利技术公开了一组含有核糖体结合位点的连接序列及应用。利用该序列在大肠杆菌中异源表达二甲苯单加氧酶可以显著的提高重组菌转化2，5－二甲基吡嗪生产5－甲基吡嗪－2－羧酸时的转化率和效率。时的转化率和效率。

【技术实现步骤摘要】
一组含有核糖体结合位点的连接序列及应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一组表达二甲苯单加氧酶含有核糖体结合位点的连接序列及应用。

技术介绍

[0002]5‑
甲基吡嗪
‑2‑
羧酸(MPCA)是一种重要的医药中间体，主要用于合成降血糖药物、降血脂药物以及治疗结核病药物。目前工业化生产的方法主要是化学合成，过程中使用了许多有毒有害物质，对环境造成严重污染。生物合成法能够有效避免这些问题，其中利用来源于PseudomonasputidaATCC 33015中三个氧化酶(二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶)可以将底物2,5－二甲基吡嗪(DMP)逐步氧化，最终生物合成MPCA。苯甲醛脱氢酶由基因xylC编码(NCBI编号：HXE35_RS00455)，二甲苯单加氧酶含有两个亚基分别由xylM、xylA编码(NCBI编号：HXE35_RS00450、HXE35_RS00445)，苯甲醇脱氢酶由基因xylB编码(NCBI编号：HXE35_RS00440)。这4个基因在菌株Pseudomonasputida ATCC 33015中的质粒PWWO(NCBI编号：NC_003350)中成簇排列。因而利用大肠杆菌异源表达这三个酶，是高效生物合成MPCA的一条可行路线。
[0003]基于上述问题，专利技术人设计了一组包含核糖体结合位点连接序列，从而显著地提高了重组大肠杆菌转化DMP形成MPCA的转化率和效率。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在设计一组高效表达二甲苯单加氧酶的连接序列以及重组大肠杆菌的构建方式及应用。
[0005]所述的一组连接序列是指基因xylC与xylM的连接序列SEQ ID No 1(RBS1)和基因xylM与xylA的连接序列SEQ ID No 2(RBS2)。
[0006]所述重组大肠杆菌的构建与应用是指将xylC、xylM、xylA、xylB插入pET28a的Nco I和Not I酶切位点，并导入大肠杆菌BL21(DE3)中，该重组大肠杆菌能高效转化DMP合成MPCA。
具体实施方式
[0007]以下结合具体实施例，对本专利技术进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术，而非用于限定本专利技术的范围。
[0008]实例中，TB培养基的配方如下：
[0009]胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L,甘油5g/L,磷酸二钾2.31g/L,磷酸氢二钾，三水16.43g/L。
[0010]实例中，LB培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基另添加1.5％琼脂粉。
[0011]实施例1、含RBS1、RBS2连接序列重组菌的构建
[0012]所述的含RBS序列过表达二甲苯单加氧酶载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
[0013]1.首先以Pseudomonasputida ATCC 33015菌株为模板，利用基因xylC的上游引物(5
’‑
一步克隆试剂所需同源片段+基因xylC上游
[0014]‑3’
)和基因xylC的下游引物(3
’‑
基因xylC的下游+Nco I和Not I酶切位点+一步克隆试剂所需同源片段
‑5’
)，获得含有xylC基因带有两个酶切位点的片段。将载体pET28a(+)用Nco I和Not I酶切后，用一步克隆试剂相连接获得pET28a
‑
xylC质粒且在xylC基因后带有Nco I和Not I酶切位点。
[0015]2.以PseudomonasputidaATCC 33015菌株为模板，利用xylM基因的上游引物(5
’‑
一步克隆试剂所需同源片段+RBS1连接序列+基因xylM的上游
‑3’
)和xylB基因的下游引物(3
’‑
基因xylB的下游
[0016]+一步克隆试剂所需同源片段
‑5’
),获得RBS1－xylM
‑
xylA
‑
xylB基因片段。将pET28a
‑
xylC质粒用Nco I和Not I酶切后，利用一步克隆试剂进行连接得到含有RBS1的载体pET28a
‑
xylC
‑
RBS1
‑
xylM
‑
xylA
‑
xylB。将质粒转入E.coli BL21(DE3)
[0017]中得到重组菌E.coli
‑
C
‑
RBS1
‑
MAB。
[0018]3.以重组菌E.coli
‑
C
‑
RBS1
‑
MAB为模板，利用基因xylC的上游引物(5
’‑
一步克隆试剂所需同源片段+基因xylC上游
‑3’
)和基因xylM的下游引物(3
’‑
基因xylM的下游+Nco I和Not I酶切位点+
[0019]一步克隆试剂所需同源片段
‑5’
)，获得含有xylC
‑
RBS1
‑
xylM基因带有两个酶切位点的片段。将载体pET28a(+)用Nco I和Not I酶切后，用一步克隆试剂相连接获得pET28a
‑
xylC
‑
RBS1
‑
xylM质粒且在xylM基因后带有Nco I和Not I酶切位点。
[0020]4.以重组菌E.coli
‑
C
‑
RBS1
‑
MAB为模板，利用xylA基因的上游引物(5
’‑
一步克隆试剂所需同源片段+RBS2连接序列+基因xylA的上游
‑3’
)和xylB基因的下游引物(3
’‑
基因xylB的下游+一步克隆试剂所需同源片段
‑5’
)，获得RBS2
‑
xylA
‑
xylB基因片段。将pET28a
‑
xylC
‑
RBS1
‑
xylM质粒用Nco I和Not I酶切后，利用一步克隆试剂进行连接得到含有RBS1和RBS2连接片段的载体pET28a
‑
xylC
‑
RBS1
‑
xylM
‑
RBS2
‑
xylA
‑
xylB。将质粒转入E.coli BL21
[0021](DE3)中得到重组菌E.coli
‑
C
‑
RBS1
‑
M
‑
RBS2
‑
AB。
[0022]实施例2、重组菌E.coli...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组含有核糖体结合位点的连接序列及应用，其特征在于，利用该连接序列构建的重组大肠杆菌可以高效转化2,5－二甲基吡嗪生成5－甲基吡嗪－2－羧酸。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫衡，甘露茜，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：