一种抗鸡CD86单克隆抗体的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种抗鸡CD86单克隆抗体的制备方法及应用，通过原核表达系统制备鸡CD86重组蛋白，并将其作为免疫原制备了抗chCD86单克隆抗体，该抗体能特异性识别chCD86天然蛋白。本发明专利技术填补了鸡CD86蛋白免疫检测的知识和技术空白，并为研究CD86在鸡生理与病理条件下的表达变化提供了有效工具。本发明专利技术中的chCD86抗体易于大量生产，便于后期在养鸡业和家禽免疫学基础研究中的应用。学基础研究中的应用。学基础研究中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种抗鸡CD86单克隆抗体的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种抗鸡CD86单克隆抗体的制备方法及应用，具体涉及重组蛋白表达、单克隆抗体的制备及其应用，属于禽免疫学、生物制品和诊断试剂领域。

技术介绍

[0002]CD86作为一种关键的免疫共刺激分子，通常表达于巨噬细胞(MΦ)、树突状细胞(DC)以及活化的B细胞表面[1]。在T细胞通过TCR
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多肽
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MHC复合物发生活化时，CD86可与另一个共刺激分子CD80形成异源二聚体，之后与T细胞上的CD28或CTLA
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4受体相结合，提供T细胞活化或抑制的第二个共刺激信号；该信号轴在启动、维持和调节T细胞活化、增殖或抑制等方面具有至关重要的作用[2]。目前人和鼠CD86已得到深入研究，利用抗人或鼠CD86抗体能够深入研究抗原提呈细胞(如MΦ、DC等)的表型和功能以及T细胞激活机制[3]。然而，截至目前，关于禽类特别是鸡CD86(chCD86)的研究仍十分匮乏。由于缺乏功能性的抗chCD86抗体，至今不能准确定义和研究鸡抗原递呈细胞的表型和功能。
[0003]在小鼠上，CD86基因编码一个由309个氨基酸组成的糖蛋白，分子量为34.7kDa，其包含一个23个氨基酸的信号肽，具有明确的胞内区，跨膜区和胞外区定位，其胞外区约为第24
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244位氨基酸；天然的CD86蛋白高度糖基化，分子量约为70kDa之间[4]。相较之下，鸡CD86基因编码区包含875个碱基，编码283个氨基酸，包含一个19个氨基酸的信号肽以及5～6个糖基化位点。通过TMHMM
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2.0网址预测鸡CD86胞外区序列约为第20
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244位氨基酸，与小鼠胞外区序列基本一致。但目前尚不清楚天然的鸡CD86蛋白的真正分子量大小。
[0004]CD86在T细胞免疫应答中发挥关键作用。有研究表明，CD86与T细胞表面受体CD28的结合能够刺激T细胞活化并启动适应性免疫应答[5]。在肿瘤免疫中，通过阻断CD86与T细胞表面受体CTLA
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4的结合，促进T细胞激活，能够有限抑制肿瘤的生长，起到了抗肿瘤作用[6]。在移植排斥反应中，CD86和CTLA
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4通路在控制T细胞对外来抗原反应中扮演着重要角色，为移植排斥反应研究提供了新的靶点。
[0005]在本专利技术中，我们公开了一种的鸡CD86真核及原核重组蛋白制备方法，制备了抗鸡CD86单克隆抗体1C2。该单抗经Western blot等技术可特异性识别鸡CD86真核及天然蛋白，并能用于流式细胞术检测鸡巨噬细胞膜表面表达的CD86蛋白。该单抗的获得为研究禽免疫学提供了重要工具。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种抗鸡CD86单克隆抗体的制备方法及应用，用以解决上述
技术介绍
提出的技术问题；本专利技术要解决的技术问题是成功制备出重组chCD86原核蛋白及真核蛋白。本专利技术还需解决的技术问题是制备抗鸡CD86的单克隆抗体。并利用该抗体实现检测鸡抗原递呈细胞(巨噬细胞和树突状细胞)表面表达的天然CD86蛋白。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种制备重组鸡CD86蛋白的原核表达方法，将chCD86胞外区片段构建到原核表达载体pET
‑
28a，经转化大肠杆菌中进
行诱导表达，获得重组鸡CD86蛋白。
[0008]chCD86胞外区序列来自Genbank序列(Genbank登录号:EF554724.1)。
[0009]一种制备重组鸡CD86蛋白的真核表达方法，完整的鸡CD86基因被构建到真核表达载体pCAGGS(pCAGGS
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chCD86)，重组质粒转染DF
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1细胞表达鸡CD86真核蛋白。
[0010]完整鸡CD86基因序列来自Genbank序列(Genbank登录号:EF554724.1)。
[0011]一株抗鸡CD86蛋白单克隆抗体1C2，所述单克隆抗体1C2能够特异性识别真核和原核表达的重组鸡CD 86蛋白以及鸡巨噬细胞表面天然表达的CD86蛋白，并能用于流式细胞术表面染色。
[0012]所述的抗鸡CD86蛋白单克隆抗体1C2杂交瘤细胞株的制备方法，将所述重组鸡CD86蛋白免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术，经所述的真核表达鸡CD86蛋白筛选而获得的单克隆抗体细胞株，即杂交瘤细胞株1C2；
[0013]所述杂交瘤细胞株1C2保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉，武汉大学；保藏日期为2023年6月18日；保藏编号为CCTCC NO:C2023173。
[0014]所述的抗鸡CD86蛋白单克隆抗体1C2用于western
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blot、间接免疫荧光试验、流式细胞术检测鸡免疫细胞和组织中CD86表达变化的应用。
[0015]通过本专利技术，构建pET28a
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ed
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chCD86和pCAGGS
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chCD86质粒，并分别在BL21(DE3)菌和DF
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1细胞中表达chCD86重组蛋白。重组chCD86原核蛋白免疫BALB/c小鼠三次，取脾脏与SP2/0细胞融合并筛选出阳性杂交瘤细胞，对不同杂交瘤细胞株分泌的抗体进行chCD86真核蛋白鉴定，并制备腹水、纯化抗体，通过Western blot鉴定测定不同抗体与chCD86真核蛋白及天然蛋白的反应性。
[0016]有益效果：本专利技术通过原核表达系统制备鸡CD86重组蛋白，并将其作为免疫原制备了抗chCD86单克隆抗体，该抗体能特异性识别chCD86天然蛋白。本专利技术填补了鸡CD86蛋白免疫检测知识和技术空白，并为研究鸡CD86在生理与病理条件下的表达变化提供了有效工具。本专利技术中的chCD86抗体易于大量生产，便于后期在养鸡业和家禽免疫学基础研究中的应用。
[0017]本专利技术制备了鸡CD86原核重组蛋白，将其作为免疫原通过杂交瘤技术制备了抗鸡CD86单克隆抗体；该抗体能够识别天然的鸡CD86蛋白，并能应用于流式细胞术表面染色。本专利技术制备的抗鸡CD86单克隆抗体可作为免疫检测工具，检测表达鸡CD86的免疫细胞，如巨噬细胞和树突状细胞等。生产的抗鸡CD86单克隆抗体可进行大量制备，并作为一种流式抗体应用于鸡免疫细胞的流式表面染色，在鸡病预防和疫苗开发中具有重要的经济价值。
附图说明
[0018]图1为pET28a
‑
ed
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chCD86重组质粒的构建，包括chCD86 PCR扩增(a)、质粒图谱(b)及质粒酶切鉴定(c)；M:DNA Marker；1:chCD86；2:pET28a
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ed
‑
chCD86质粒双酶切鉴定。
[0019]图2为chCD86原核表达(a)、蛋白纯化与复性(b)；其中:
[0020]a图，M:Pr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备重组鸡CD86蛋白的原核表达方法，其特征在于，将鸡CD86胞外区片段构建到原核表达载体pET
‑
28a，经转化大肠杆菌中进行诱导表达，获得重组鸡CD86蛋白。2.根据权利要求1所述的一种制备重组鸡CD86蛋白的原核表达方法，其特征在于，鸡CD86胞外区序列来自Genbank序列(Genbank登录号: EF554724.1)。3.一种制备重组鸡CD86蛋白的真核表达方法，其特征在于，完整的鸡CD86基因被构建到真核表达载体pCAGGS上，重组质粒（pCAGGS
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chCD86）转染DF
‑
1细胞表达鸡CD86真核蛋白。4.根据权利要求3所述的一种制备重组鸡CD86蛋白的真核表达方法，其特征在于，完整的鸡CD86基因序列来自Genbank序列(Genbank登录号: EF554724.1)。5.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：商绍彬，尹诗，贺双江，郝小利，杨奕，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：