一种培养肿瘤类器官的试剂盒和方法技术

本发明专利技术提供一种培养肿瘤类器官的试剂盒和方法，试剂盒包括组织液I和组织液II，组织液I包括以下成分：细胞完全培养基、5～15vol％胎牛血清、0.2～8wt％透明质酸酶、0.05～0.2wt％胶原蛋白酶II、0.2～0.8wt％纤维蛋白溶酶、0.1～0.5wt％间质溶素MMP

【技术实现步骤摘要】
一种培养肿瘤类器官的试剂盒和方法


[0001]本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种培养肿瘤类器官的试剂盒和方法，以及肿瘤类器官在药物筛选以及治疗效果预测上的应用。

技术介绍

[0002]癌症是最令人担心的健康问题之一，也是全球死亡的主要原因。最近，癌症药物的发展为个性化治疗提供了新的机会。然而，个性化治疗伴随而来的是预测患者对某种药物反应的需求。距上世纪50年代第一个癌症细胞系HeLa以来，已经开发了数百种癌细胞系。这些癌细胞系是癌症生物学研究和抗癌治疗评估的常用工具。大多数癌细胞系已经在实验室的常用培养基中增殖迭代无数次，这种以2D形式培养的方式随着时间的推移，会导致细胞逐渐变得不像体内原初的癌细胞。虽然细胞系对于确定药物是否应进入临床试验很重要，但2000年至2015年间进行的一项研究表明，只有3.4％的癌症靶向药物通过了临床试验并被批准用于患者治疗。这些统计数据表明，我们需要寻找更好的临床前药物筛选模型。
[0003]在过去的几年中，一些研究表明肿瘤类器官提供了较为准确的抗癌药物筛选数据。类器官的起源可以追溯到1907年，当时44岁的美国贝克罗莱那大学教授威尔逊发现通过机械分离的海绵细胞可以重新聚集，并自组织成为新的具有正常功能的海绵有机体，他的研究结果于1910年发表。而当代类器官的发展，在过去十几年中一直是一个新兴领域，在Pubmed上搜索“类器官”这一关键词，相关文章从2010年的42篇，跃升到2020年的2097篇。可见类器官以极迅猛的态势成为研究热点。然而，传统的肿瘤类器官同样需要患者的癌细胞在离体情况下培养迭代数次，然后增殖出具有立体结构的肿瘤类器官。在离体培养的这段时间里，癌细胞特性发生了怎样的隐匿变化，我们不得而知。因此，某种程度上，传统的肿瘤类器官仍然带有一定的不确定性。
[0004]除此之外，传统类器官在制备或应用过程中存在以下问题：(1)在制备过程中无法绕开细胞团培养环节，这一环节通常需耗时2至4周不等，因此会将整个病人等待结果的时间拖延很久。然而对于癌症患者而言，时间就是生命，越早给出药筛结果，使患者对症下药，对于患者越有利。(2)由于传统类器官由单细胞或小细胞团生长而来，因此在没有毛细血管网以及纤维网的环境中，细胞需要以凝胶作为依附框架，生长成类器官。因此传统类器官如果需要生长至较大体积，则需使用凝胶包埋，而这样不利于细胞疗法如CAR
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NK细胞或CAR
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T细胞的效果测试，同时药筛过程中，药物无法直接接触类器官，需穿过凝胶再作用类器官，在此过程中，如果有小分子多肽药，则药物有可能被具有多孔结构的凝胶吸附，其药效有降低的风险，因此药筛结果可能出现偏差。(3)传统类器官只有部分小体积类器官可以悬浮培养，但类器官内部结构松散，容易散落成小细胞团。(4)传统类器官在培养过程中会经历细胞的增殖和迭代，而离体条件下，细胞每次迭代，都面临性状改变的风险，这种改变可能会使人毫无察觉，但最终导致药物筛查的结果出现偏差。因此传统类器官较多用于基础科学研究，而用于临床药筛时可能会存在因细胞性状改变而导致药筛结果出现偏差的问题。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术存在的不足与问题，本专利技术提供了一种培养肿瘤类器官的试剂盒以及方法，在该试剂盒的作用下，所制备得到的肿瘤类器官产物本身具有生物活性，可直接用于药物筛选或后续培养，在药物筛选方面节约了大量时间成本。在临床研究方面保留了肿瘤组织原先的细胞排布结构和特性。在基础科研方面可以继续培养成肿瘤原代细胞或传统类器官，相当于原代细胞和传统类器官的母体。
[0006]根据本专利技术的第一个方面，提供一种培养肿瘤类器官的试剂盒，包括组织液I和组织液II，组织液I包括以下成分：细胞完全培养基、5～15vol％胎牛血清、0.2～8wt％透明质酸酶、0.05～0.2wt％胶原蛋白酶II、0.2～0.8wt％纤维蛋白溶酶、0.1～0.5wt％间质溶素MMP
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7；组织液II包括以下成分：细胞完全培养基、1～3vol％胎牛血清、0.2～0.8wt％透明质酸酶、0.05～0.2wt％胶原蛋白酶II、0.05～0.15wt％人工重组CYR61蛋白。
[0007]在本专利技术提供的试剂盒中，组织液I和组织液II皆较为温和，可以直接对临床上直接获得的肿瘤组织进行处理，能够仅溶解掉肿瘤细胞外结缔组织、毛细血管和微小血块，保留肿瘤细胞连接，得到具有生物活性的组织块，即CTO(临床肿瘤类器官)，可直接用于药筛。另外，组织液II中还含有较少量的胎牛血清和人工重组CYR61蛋白，较少量的胎牛血清可以使肿瘤细胞饥饿，使后续类器官的生长和贴壁速度更快，而人工重组CYR61蛋白有利于减少肿瘤组织在处理过程中的损伤，有利于组织块的高活性保持。进一步，通过将组织液I与组织液II搭配使用，有利于满足肿瘤类器官在制备过程中各阶段的处理要求，降低处理过程的损伤，提高肿瘤类器官的活性，有利于肿瘤类器官的后续使用。
[0008]在本专利技术中，所采用的人工重组CYR61可商业购买，其为富半胱氨酸蛋白61，是CCN(Cyr61，CTGF，NOV)蛋白家族成员之一，为即刻早期基因，是重要的细胞基质调节因子。Cyr61具有明显的促有丝分裂活性和趋化性，参与调节细胞的增殖、转移、粘附，并和血管形成相关。Cyr61在肿瘤中表现的生物学功能是多样的，在不同的肿瘤组织细胞中，Cyr61的表达水平和功能不同。但是目前,Cyr61与肿瘤的确切关系及其机理尚不清楚，且将其利用在制备肿瘤类器官的应用上也少有报道。
[0009]优选地，组织液I包括以下成分：细胞完全培养基、10vol％胎牛血清、0.5wt％透明质酸酶、0.125wt％胶原蛋白酶II、0.5wt％纤维蛋白溶酶、0.25wt％间质溶素MMP
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7。
[0010]优选地，组织液II包括以下成分：细胞完全培养基、2vol％胎牛血清、0.5wt％透明质酸酶、0.125wt％胶原蛋白酶II、0.1wt％人工重组CYR61蛋白。
[0011]优选地，试剂盒还包括类器官专用保存液，器官专用保存液包括以下组分：低糖培养基、2vol％血清、0.02wt％偏钨酸钠。
[0012]类器官专用保存液可用来保存从临床上直接获取的肿瘤组织，目的是降低组织细胞代谢，保持肿瘤组织的新鲜程度。
[0013]根据本专利技术的另一方面，提供一种培养肿瘤类器官的方法，包括以下步骤：
[0014]S1.从临床上获取肿瘤组织，置于类器官专用保存液，待用；
[0015]S2.取出肿瘤组织，清洗后置于无菌容器内，利用无菌针头扎孔至蜂窝状；
[0016]S3.将组织液I注入肿瘤组织，直至所有孔洞均有液体流出；
[0017]S4.将肿瘤组织置于装有组织液I的离心管中，液体量可覆盖全部肿瘤组织，随后将离心管置于培养箱中进行摇动解离；
[0018]S5.离心，弃去上清液，保留沉降在管底的组织块，用细胞完全培养基清洗2～3次；
[0019]S6.向S5中清洗后的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养肿瘤类器官的试剂盒，其特征在于：包括组织液I和组织液II，所述组织液I包括以下成分：细胞完全培养基、5～15vol％胎牛血清、0.2～8wt％透明质酸酶、0.05～0.2wt％胶原蛋白酶II、0.2～0.8wt％纤维蛋白溶酶、0.1～0.5wt％间质溶素MMP
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7；所述组织液II包括以下成分：细胞完全培养基、1～3vol％胎牛血清、0.2～0.8wt％透明质酸酶、0.05～0.2wt％胶原蛋白酶II、0.05～0.15wt％人工重组CYR61蛋白。2.如权利要求1所述培养肿瘤类器官的试剂盒，其特征在于：所述组织液I包括以下成分：细胞完全培养基、10vol％胎牛血清、0.5wt％透明质酸酶、0.125wt％胶原蛋白酶II、0.5wt％纤维蛋白溶酶、0.25wt％间质溶素MMP
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7。3.如权利要求1所述培养肿瘤类器官的试剂盒，其特征在于：所述组织液II包括以下成分：细胞完全培养基、2vol％胎牛血清、0.5wt％透明质酸酶、0.125wt％胶原蛋白酶II、0.1wt％人工重组CYR61蛋白。4.如权利要求1所述培养肿瘤类器官的试剂盒，其特征在于：还包括类器官专用保存液，所述器官专用保存液包括以下组分：低糖培养基、2vol％血清、0.02wt％偏钨酸钠。5.一种培养肿瘤类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.从临床上获取肿瘤组织，置于类器官专用保存液，待用；S2.取出所述肿瘤组织，清洗后置于无菌容器内，利用无菌针头扎孔至蜂窝状；S3.将组织液I注入所述肿瘤组织，直至所有孔洞均有液体流出；S4.将所述肿瘤组织置于装有所述组织液I的离心管中，液体量可覆盖全部所述肿瘤组织，随后将离心管置于培养箱中进行摇动解离；S5.离心，弃去上清液，保留沉...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾皓宇，沈振波，关天，林燕纯，李芸，丁哲纯，陈冬妹，
申请(专利权)人：广东普罗凯融生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：