一种植物乳杆菌及其在合成高光学纯度L-苯乳酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物乳杆菌及其在合成高光学纯度L

【技术实现步骤摘要】
一种植物乳杆菌及其在合成高光学纯度L
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苯乳酸中的应用


[0001]本专利技术属于应用微生物学领域，具体涉及一种植物乳杆菌及其在合成高光学纯度L
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苯乳酸中的应用。

技术介绍

[0002]苯乳酸(Phenyllactic acid，简称PLA)，又称2
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羟基
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苯基丙酸，是一种具有广谱抑菌活性的天然抗菌物质，广泛存在于蜂蜜、酸奶、泡菜等发酵食品中，对大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、青霉、曲霉等大多数食源性致病细菌和真菌均具有很好的抑制作用。PLA对人和动物细胞无毒、具有良好的水溶性、独特的耐酸碱性和热稳定性，可耐受常规高温高压灭菌，这些优良特性使其有望成为继乳酸、Nisin、聚赖氨酸之后的新一代天然生物防腐剂，在食品、医药、化妆品、饲料和生物材料等领域都有广阔的应用前景。PLA分子中含有一个手性碳原子，因此有D
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苯乳酸(DPLA)和L
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苯乳酸(LPLA)两种对映异构体。DPLA和LPLA除了构型不同，熔点、沸点、相对密度、溶解性等理化性质完全相同，抑菌效果大体一致却略有差异。但两种对映异构体作为中间体或手性砌块在药物合成中的应用完全不同，尤其是在生物基新材料聚苯乳酸的合成过程中，需要高光学纯度的单一对映异构体。因此，制备高光学纯度的DPLA或LPLA已成为近年来的研究热点，是PLA在食品、医药、生物材料等领域广泛应用的前提。
[0003]PLA的生产方法有化学合成法和生物合成法，化学合成法得到的PLA多为消旋的DL
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PLA，若要得到DPLA或LPLA，需进行对映异构体手性拆分。化学法制备DPLA或LPLA成本较低，但合成过程中不可避免的要使用到毒性较大的溶剂，废液处理和环境污染问题比较突出，因而近些年有关PLA的制备方式从化学合成逐渐转向生物合成。自然界中PLA产生菌种质资源丰富，已报道的微生物如丙酸杆菌、乳酸杆菌、白地霉菌、芽孢杆菌等都可通过自身代谢合成PLA。1986年日本味之素Kamata等人用从土壤中分离的一株乳糖发酵短杆菌合成DPLA，其产量达1.94g/L。1998年Dieuleveux等用从干酪中分离的一株白地霉合成DPLA，其产量为0.6～1.0g/L。2000年Lavermlcocca等首次报道了从酸面团中分离出的植物乳杆菌L.Plantarum 21B可产56mg/L的DPLA，随后许多种属的乳酸菌都被研究证实可以合成PLA。乳酸菌作为一类公认安全的微生物，是发酵合成PLA的理想菌种。2002年Katrin等从青贮饲料中分离出产LPLA和DPLA的比例为9:1的L.Plantarum MinLAB 393。2007年李兴峰等从发酵泡菜中筛选到一株植物乳杆菌L.Plantarum SK007，在含L
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苯丙氨酸的MRS培养基中可产183mg/L的PLA，以苯丙酮酸替代苯丙氨酸作为底物时，PLA产量提高至2.81g/L。
[0004]乳酸菌主要通过苯丙氨酸途径合成PLA，首先苯丙氨酸在氨基转移酶催化下发生转氨反应生成苯丙酮酸，然后苯丙酮酸在乳酸脱氢酶催化下发生还原反应生成PLA。自然界中存在D和L两种乳酸脱氢酶，大多数乳酸菌至少含有D或L其中一种乳酸脱氢酶，因此合成PLA的过程中一般会同时产生D型和L型两种PLA。如前所述，目前利用乳酸菌发酵产生PLA的报道大多集中在DPLA，仅有极少数利用乳酸菌合成LPLA的报道。中国专利CN201810467470.71公开了从一种植物乳杆菌中分离PLA的方法，纯化后的PLA中LPLA的质
量百分比为92～98％，ee值不高于96％。中国专利CN201810037177.7公开了一种副干酪乳杆菌在合成PLA中的应用，CN202011174207.2公开了一株从醋醅中分离筛选出的产PLA的干酪乳杆菌，CN202010896770.4公开了一株产PLA的植物乳杆菌及其在发酵豆粕中的应用，但均没有报道PLA的光学纯度以及对映异构体DPLA和LPLA的比例，更没有涉及植物乳杆菌在高光学纯度LPLA发酵生产中的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种植物乳杆菌并应用于合成L
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苯乳酸，所述合成方法的L
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苯乳酸光学纯度高，发酵单位产量高。
[0006]本专利技术的第一方面，提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DBPLA2021，属于乳杆菌属的亚种，是专利技术人从湖南省岳阳县华容县芥菜产业园采集的发酵芥菜样品中，经初筛、复筛和分离纯化得到，该菌株已于2023年3月6日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编：430072)，保藏编号CCTCC NO:M2023206。
[0007]本专利技术的第二方面，提供一种菌剂，其包含前述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DBPLA2021或其发酵液。
[0008]本专利技术的第三方面，提供前述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DBPLA2021或菌剂在制备高光学纯度L
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苯乳酸中的应用；进一步地，所述高光学纯度L
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苯乳酸为光学纯度≥99.5％的L
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苯乳酸。
[0009]本专利技术的第四方面，提供一种L
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苯乳酸的合成方法，通过前述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DBPLA2021的生长细胞发酵或静息细胞转化合成L
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苯乳酸。
[0010]所述通过植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DBPLA2021的生长细胞发酵合成L
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苯乳酸的方法包括如下步骤：
[0011]a1、种子液培养：将植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)DBPLA2021试管斜面接种至MRS液体培养基中，于温度30℃，搅拌转速220rpm下震荡培养16h，得种子液；
[0012]a2、发酵培养：将所述种子液以5％v/v接种量接种至发酵培养基中，于温度30℃，搅拌转速300～800rpm，通气量0.5～1.5m3/h，溶氧30～50％条件下培养36h，培养过程流加30％的氨水维持pH在5.5～6.0，并在培养至第12h和第24h时分别补加2g/L的苯丙酮酸，得发酵液；
[0013]所述发酵培养基包括以下终浓度的各组分：苯丙酮酸3～6g/L、玉米浆干粉10～20g/L、酵母提取物4～8g/L、酵母蛋白胨5～15g/L、葡萄糖20～40g/L、碳酸钙10～30g/L、乙酸钠4～8g/L、柠檬酸三铵1～3g/L、磷酸二氢钾3～8g/L、七水硫酸镁0.1～0.3g/L、一水硫酸锰0.03～0.07g/L、吐温
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80 1～3g/L，溶剂为去离子水，调pH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DBPLA2021，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M2023206。2.一种菌剂，其特征在于，其包含权利要求1所述植物乳杆菌DBPLA2021或其发酵液。3.权利要求1所述植物乳杆菌DBPLA2021或权利要求2所述菌剂在合成高光学纯度L
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苯乳酸中的应用；优选的，所述高光学纯度L
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苯乳酸为光学纯度≥99.5％的L
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苯乳酸。4.一种L
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苯乳酸的合成方法，其特征在于，通过权利要求1所述植物乳杆菌DBPLA2021的生长细胞发酵或静息细胞转化合成L
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苯乳酸。5.根据权利要求4所述L
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苯乳酸的合成方法，其特征在于，所述通过植物乳杆菌DBPLA2021的生长细胞发酵合成L
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苯乳酸的方法包括如下步骤：a1、种子液培养：将植物乳杆菌DBPLA2021试管斜面接种至MRS液体培养基中，于温度30℃，搅拌转速220rpm下震荡培养16h，得种子液；a2、发酵培养：将所述种子液以5％v/v接种量接种至发酵培养基中，于温度30℃，搅拌转速300～800rpm，通气量0.5～1.5m3/h，溶氧30～50％条件下培养36h，培养过程流加30％的氨水维持pH在5.5～6.0，并在培养至第12h和第24h时分别补加2g/L的苯丙酮酸，得发酵液；所述发酵培养基包括以下终浓度的各组分：苯丙酮酸3～6g/L、玉米浆干粉10～20g/L、酵母提取物4～8g/L、酵母蛋白胨5～15g/L、葡萄糖20～40g/L、碳酸钙10～30g/L、乙酸钠4～8g/L、柠檬酸三铵1～3g/L、磷酸二氢钾3～8g/L、七水硫酸镁0.1～0.3g/L、一水硫酸锰0.03～0.07g/L、吐温
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80 1～3g/L，溶剂为去离子水，调pH至6.5～7.0；a3、分离纯化：将所述发酵液分离纯化，得L
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苯乳酸。6.根据权利要求5所述L
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苯乳酸的合成方法，其特征在于：步骤a1中，所述MRS液体培养基包括以下终浓度的各组分：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸三铵2g/L、磷酸二氢钾5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、一水硫酸锰0.05g/L、吐温80 1g/L，溶剂为去离子水，调pH至6.2～6.4；和/或，步骤a2中，所述发酵培养基包括以下终浓度的各组分：苯丙酮酸4g/L、玉米浆干粉15g/L、酵母提取物5g/L、酵母蛋白胨10g/L、葡萄糖30g/L、碳酸钙20g/L、乙酸钠6g/L、柠檬酸三铵2g/L、磷酸二氢钾5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、一水硫酸锰0.05g/L、吐温
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80 2g/L，溶剂为去离子水；和/或，步骤a3中，所述分离纯化为：向发酵液中加酸使酸化，得酸化液；将所述酸化液固液分离弃沉淀，得上清液；将所述上清液依次进行乙酸乙酯萃取、浓缩；优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，胥龙奇，李剑，邓志强，刘彤，许国超，彭滢，
申请(专利权)人：大邦湖南生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：