一种CRISPR-Cas9介导的同步双基因编辑系统及其在曲霉中的应用技术方案

本发明专利技术公开了一种CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统及其在曲霉中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统及其在曲霉中的应用。

技术介绍

[0002]CRISPR
‑
Cas9系统由切割DNA双链的Cas9核酸酶和导向功能的sgRNA(single guide RNA)两部分组成。在细胞内，当Cas9蛋白和sgRNA同时存在并结合为复合体时，经由sgRNA导引至特异性的靶序列处，由Cas9蛋白进行切割，并产生DNA双链断裂(DNA double strand breaks，DSBs)，进而引发胞内的DNA修复机制。在真核生物中有两种修复方式:同源重组修复(homology directed repair，HDR)和非同源重组修复(non
‑
homologous DNAend joining，NHEJ)。虽然经过十几年的发展，CRISPR
‑
Cas9基因组编辑方法已被广泛应用于多个物种的基因编辑，成为生物育种和合成生物学中基因改造的有效工具，但是仍有很多不足如精准编辑位点效率低导致脱靶、筛选标记在野生型菌株中的缺乏、转化体系在不同物种中不能通用等等问题。因此，各领域的研究者仍然在寻找适合不同物种的高效基因编辑体系。丝状真菌是一类多细胞(少数也为无膈膜单细胞)的真菌类别，由于它们都具有坚硬的细胞壁使得外源DNA等物质进入难度大，且多样性丰富的丝状真菌大多来自于工、农业和临床医学等环境，这些菌株均缺少筛选标记，使得基因编辑尤其是多基因编辑难度大，因此，丝状真菌基因编辑技术远远落后于其它高等动、植物等物种。
[0003]构巢曲霉中多个菌株具备了基因组测序的数据，它也是用于基础研究的模式丝状真菌，因此其形态、生理、代谢途径和遗传调控方面的研究已经具备了一定的积累。然而，目前大多研究聚焦在构巢曲霉产酶领域，而其他初级产物如有机酸产生的调控则鲜有报道，这在一定程度上限制了构巢曲霉潜力的开发和应用的扩展。同时在构巢曲霉中，目前主要采用的是同源重组基因替换的方法来完成目的基因的敲除，比较低效和费时、费力。目前存在的技术问题包括以下三点：(1)缺乏有效的筛选标记，导致多基因编辑无法完成；(2)由于丝状真菌具有很强的非同源DNA修复能力，目的基因编辑效率不高且脱靶发生造成非目的基因的编辑的副作用；(3)多基因编辑经常需要多次转化完成造成费时费力，效率低下是合成生物学的限速因子。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统，在构巢曲霉的菌株中构建一个高效的基因编辑体系，以提高工程菌株基因编辑的效率。同时，通过使用所建立的基因编辑技术快速的对构巢曲霉胞内的rTCA途径进行改造，以获得高产目的产物的工程菌株底盘细胞，同时有效提高构巢曲霉产L
‑
苹果酸。
[0005]本专利技术还提供所述CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统的应用。
[0006]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编
辑系统，所述同步双基因编辑系统包括CRISPR
‑
Cas9系统和Cre
‑
loxP系统，所述CRISPR
‑
Cas9系统对靶基因进行定点敲除，Cre
‑
loxP系统与高表达的基因组成修复模板，修复模板在微同源臂的引导下整合在敲除靶基因的位置；所述修复模板包括组成型启动子、营养筛选标记、高表达的基因以及来自靶基因的微同源臂。
[0007]本专利技术所述一种构巢曲霉的CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统，所述同步双基因编辑系统包括CRISPR
‑
Cas9系统和Cre
‑
loxP系统，所述CRISPR
‑
Cas9系统对靶基因进行定点敲除，Cre
‑
loxP系统与高表达的基因组成修复模板，在微同源臂的引导下整合在敲除靶基因的位置，通过一次转化完成对靶基因A的敲除，以及对目的基因B的过表达；其中基因A设计成能被Cas9
‑
sgRNA复合物识别的靶基因，所述修复模板包括组成型启动子、营养筛选标记、基因B以及来自靶基因A的微同源臂。
[0008]作为优选，所述同步双基因编辑系统包括CRISPR
‑
Cas9敲除系统和Cre
‑
loxP系统，通过一次转化完成目的基因A的敲除，插入另一个带有高表达启动子的基因B，其中基因A设计成能被Cas9
‑
sgRNA复合物识别的靶基因，同时设计修复模板包括组成型启动子、营养筛选标记、目标基因B以及来自基因A的微同源臂。
[0009]其中，所述启动子为长度为700bp的gpdA(3
‑
磷酸甘油醛脱氢酶)启动子或者长度为1400bp的tef(翻译延伸因子)启动子。
[0010]其中，所述营养筛选标记为pyroA。
[0011]其中，所述微同源臂长度为25
‑
35bp。优选为30bp。
[0012]其中，所述启动子设计成和基因A反向的方式。
[0013]其中，由木糖诱导的启动子(Pxylp)编码的Cre重组酶基因调控的Cre
‑
loxP技术体系进行pyroA基因的删除从而达到营养标记再次使用。
[0014]本专利技术所述的构巢曲霉的CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统在构巢曲霉中完成一次转化实现同步敲除一个基因和高调另一个基因中的应用。
[0015]本专利技术所述的构巢曲霉的CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统在构巢曲霉多基因的连续编辑中的应用。
[0016]其中，所述系统对构巢曲霉细胞中的还原性TCA途径及产生草酸和柠檬酸的两条支路途径上的的五个关键基因进行编辑，所述五个关键基因编码分别是丙酮酸羧化酶的编码基因、草酸乙酰水解酶的编码基因、苹果酸脱氢酶的编码基因、C4
‑
二羧酸转运蛋白的编码基因和柠檬酸转运蛋白的编码基因。
[0017]本专利技术所述的构巢曲霉的CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统在提升构巢曲霉产L
‑
苹果酸中的应用。
[0018]本专利技术所述一株基因工程菌，以构巢曲霉TN02A7为出发菌株，通过所述的CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统，对丙酮酸羧化酶的编码基因pyc、苹果酸脱氢酶的编码基因mdhC、C4
‑
二羧酸转运蛋白的编码基因dctA高表达；对草酸乙酰水解酶oahA、柠檬酸转运蛋白的编码基因cexA敲除。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种丝状真菌中CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统，其特征在于，所述同步双基因编辑系统包括CRISPR
‑
Cas9系统和Cre
‑
loxP系统，所述CRISPR
‑
Cas9系统对靶基因进行定点敲除，Cre
‑
loxP系统与高表达的基因组成修复模板，修复模板在微同源臂的引导下整合在敲除靶基因的位置；所述修复模板包括组成型启动子、营养筛选标记、高表达的基因以及来自靶基因的微同源臂。2.一种构巢曲霉的CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统，其特征在于，所述同步双基因编辑系统包括CRISPR
‑
Cas9系统和Cre
‑
loxP系统，所述CRISPR
‑
Cas9系统对靶基因进行定点敲除，Cre
‑
loxP系统与高表达的基因组成修复模板，在微同源臂的引导下整合在敲除靶基因的位置，通过一次转化完成对靶基因A的敲除，以及对目的基因B的过表达；其中基因A设计成能被Cas9
‑
sgRNA复合物识别的靶基因，所述修复模板包括组成型启动子、营养筛选标记、基因B以及来自靶基因A的微同源臂。3.根据权利要求2所述的构巢曲霉的CRISPR
‑
Cas9介导的同步双基因编辑系统，其特征在于，所述启动子为gpdA(3
‑
磷酸甘油醛脱氢酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆玲，张驰，陈梓青，裴玲玲，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：