一种适配体-膜融合脂质体纳米药物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种适配体

【技术实现步骤摘要】
一种适配体
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膜融合脂质体纳米药物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于纳米药物的制备
，涉及一种适配体
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膜融合脂质体纳米药物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]恶性黑色素瘤的高迁移性及侵袭性，使得中后期患者在治疗过程中疗效不佳。放疗与免疫疗法的联合具有很大的应用前景，但也面临诸多挑战，如何精准的在实体瘤部位进行放射治疗及激活免疫应答是目前研究的主要内容。不幸的是，只有一小部分患者对目前可用的免疫疗法有反应。尽管越来越多的人认为免疫与放疗结合可以提高反应率，但这种方法可能受到持续辐射诱导免疫抑制的限制。免疫治疗与放射治疗相结合的最终目标是在所有疾病部位诱导从无效的、预先存在的免疫反应转变为持久的、治疗诱导的免疫反应。
[0003]现有的递送系统大多为有机或无机的纳米颗粒，包括“元老”脂质体。将治疗药物递送到作用部位的主要挑战是在靶组织、细胞或细胞器中的脱靶毒性、快速清除以及低积累和生物利用度。为了规避这些挑战，研究人员已经开发了广泛的合成输送载体(脂质体，胶束，无机纳米颗粒，树枝状聚合物等)，其中一些已经得到临床批准。在所有纳米颗粒的可用图谱中，脂质体是迄今为止最成功且市场上临床批准数量最多的载体。脂质体负载不同药物采用不同方式，脂质性药物嵌入到磷脂双分子层中；亲水性药物则加载在脂质体的管腔中。脂质体凭借其与生物体质膜类似的基本结构而具备很好的生物相容性。
[0004]机体的免疫效应分为抗体介导的体液免疫和淋巴细胞、巨噬细胞等介导的细胞免疫，正常的免疫反应能对非己的抗原产生两种免疫效应，以排斥异物发挥免疫保护作用。肿瘤细胞在发生发展过程中会通过多种机制躲避机体免疫系统的识别和攻击，得以在体内生存和增殖，称为肿瘤免疫逃逸(Tumor immune escape)。首先，肿瘤细胞的抗原缺失和抗原调变，主要组织相容性复合物I(MHCI)类分子的表达低下，其共刺激信号异常的特性使得CD80和CD86等正性刺激分子表达很少，而负性刺激信号如PD
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L1等却高表达，因此不能为激活T细胞提供有效的第二信号；其次，肿瘤部位能表达表皮细胞生长因子促进细胞生长，并且分泌TGF
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β、IL
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10等具有免疫抑制作用的多种细胞因子；再者，肿瘤细胞高表达各种抗凋亡分子，从而躲避CTLs的杀伤作用；此外，肿瘤细胞主动诱导机体产生Treg和髓源性抑制细胞来抑制免疫应答。
[0005]鉴于肿瘤细胞的这些特征，目前有许多研究针对其免疫抑制设计治疗方案，力求激活机体的免疫应答，刺激DCs成熟呈递抗原，激活T细胞。T细胞一般负责攻击并清除癌细胞，是人体免疫系统的主力军。目前临床上已经开始通过输注体外合成的单克隆PD
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1抗体来直接激活并增强体内的T细胞，使得肿瘤细胞上的PD
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L1“无从下手”，T细胞抑制被解除，让士气萎靡的“友军”重振军心，从而发挥肿瘤查杀作用。
[0006]放疗疗效有限且会导致放射抗性和肿瘤高复发转移率，这是由肿瘤缺氧、DNA损伤快速修复，特别是肿瘤的抑制性免疫微环境引起的。已有研究设计了由Hf4+和CpG ODN组成的金属骨架，证明这种骨架可以实现高Z元素增强的放射治疗，并进一步引发强大的肿瘤特
异性免疫反应，从而表现出有效的肿瘤抑制能力。放射免疫治疗具有良好的抗肿瘤作用，这取决于放射治疗对肿瘤免疫微环境的调节作用，辐射诱导的DNA损伤修复(DDR)通路激活导致免疫微环境的抑制，从而削弱了放射免疫治疗的抗肿瘤作用。
[0007]因此急需研究能够增敏放疗并逆转肿瘤的免疫抑制环境的治疗方案，发挥局部辐照作用的同时，激活肿瘤部位的免疫应答。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种适配体
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膜融合脂质体纳米药物；本专利技术的目的之二在于提供一种适配体
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膜融合脂质体纳米药物的制备方法；本专利技术的目的之三在于提供一种适配体
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膜融合脂质体纳米药物在制备治疗和/或预防恶性肿瘤的药物中的应用。
[0009]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0010]1.一种适配体
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膜融合脂质体纳米药物，所述纳米药物包括核酸适配体、肽核酸和膜融合脂质体；
[0011]所述核酸适配体首先与肽核酸(PmP)通过碱基互补的方式进行结合得到适配体/肽核酸结合体(aptATP/aptCpG/PmP(ACP))，然后用胆固醇在所述适配体/肽核酸结合体(ACP)中含有的aptATP和aptPD
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L1的3`端上进行修饰，继续插入到所述膜融合脂质体上即可得到适配体
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膜融合脂质体纳米药物(Lip@AUR
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ACP
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PDL1)，其中所述肽核酸、aptATP、aptPD
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L1和载药脂质体的摩尔比为3:2:1:80
[0012]所述膜融合脂质体按照如下方法制备：将二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂
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甲氧基聚乙二醇(DSPE
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PEG)、(2,3
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二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)和金诺芬(AUR)加入溶氯仿中，搅拌超声使其溶解后，在40～42℃的水浴条件下旋蒸成膜，通风过夜后加入无菌PBS缓冲溶液后吹打重悬，超声使其混合均匀，离心后过0.22μm滤膜，挤压机反复挤压后用透析袋透析得到膜融合脂质体(Lip@AUR)；
[0013]所述肽核酸(PmP)是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列、SEQ ID NO：2的核苷酸序列、SEQ ID NO：3氨基酸序列、SEQ ID NO：4的核苷酸序列和SEQ ID NO：1的氨基酸序列依次连接形成；
[0014]所述aptATP的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示、所述aptCpG的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示、所述aptPD
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L1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
[0015]优选的，在膜融合脂质体的制备过程中，所述二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂
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甲氧基聚乙二醇(DSPE
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PEG)、(2,3
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二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)和金诺芬(AUR)的质量比为7.255:1.516:1.963:2。
[0016]优选的，所述膜融合脂质体中金诺芬(AUR)的含量为44.7μg/mL。
[0017]优选的，所述适配体/肽核酸结合体(aptATP/aptCpG/PmP(ACP))按照如下方法制备：
[0018](1)制备aptATP/aptCpG：将aptATP的DEPC水溶液和aptCpG的DEPC水溶液在95℃下的油浴中热处理使其混合均匀，置于42℃的烘箱中孵育1h以上得到aptATP/aptCpG；
[0019](本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适配体
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膜融合脂质体纳米药物，其特征在于，所述纳米药物包括核酸适配体、肽核酸和膜融合脂质体；所述核酸适配体首先与肽核酸通过碱基互补的方式进行结合得到适配体/肽核酸结合体，然后用胆固醇在所述适配体/肽核酸结合体中含有的aptATP和aptPD
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L1的3`端上进行修饰，继续插入到所述膜融合脂质体上即可得到适配体
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膜融合脂质体纳米药物，其中所述肽核酸、aptATP、aptPD
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L1和载药脂质体的摩尔比为3:2:1:80所述膜融合脂质体按照如下方法制备：将二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、磷脂
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甲氧基聚乙二醇、(2,3
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二油氧基丙基)三甲基氯化铵和金诺芬加入溶氯仿中，搅拌超声使其溶解后，在40～42℃的水浴条件下旋蒸成膜，通风过夜后加入无菌PBS缓冲溶液后吹打重悬，超声使其混合均匀，离心后过0.22μm滤膜，挤压机反复挤压后用透析袋透析得到膜融合脂质体；所述肽核酸的核苷酸序列是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列、SEQ ID NO：2的核苷酸序列、SEQ ID NO：3氨基酸序列、SEQ ID NO：4的核苷酸序列和SEQ ID NO：1的氨基酸序列依次连接形成；所述aptATP的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述aptCpG的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述aptPD
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L1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。2.根据权利要求1所述的适配体
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膜融合脂质体纳米药物，其特征在于，在膜融合脂质体的制备过程中，所述二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、磷脂
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甲氧基聚乙二醇、(2,3
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二油氧基丙基)三甲基氯化铵和金诺芬的质量比为7.255:1.516:1.963:2。3.根据权利要求1所述的适配体
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膜融合脂质体纳米药物，其特征在于，所述膜融合脂质体中金诺芬的含量为44.7μg/mL。4.根据权利要求1所述的适配体
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膜融合脂质体纳米药物...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗忠，薛瑞，任惜娇，李孟桓，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：