过表达TLX的人诱导多能干细胞及其应用制造技术

本发明专利技术涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及过表达TLX的人诱导多能干细胞及其应用。本发明专利技术通过使人诱导多能干细胞(hiPSC)过表达TLX或其截短体，实现hiPSC向NSC的自驱动分化。该方案不仅加快hiPSC向NSC分化，还实现NSC长期稳定体外传代培养，从而为治疗神经系统疾病、细胞治疗等提供供体细胞，并且获得的NSC外泌体具有良好的生物学活性。体具有良好的生物学活性。

【技术实现步骤摘要】
过表达TLX的人诱导多能干细胞及其应用


[0001]本专利技术涉及干细胞培养
，尤其涉及过表达TLX的人诱导多能干细胞及其应用。

技术介绍

[0002]神经干细胞(NSC)是一类能够无限的自我更新并具备分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞的多能细胞，为神经发生发育的研究，神经系统疾病模型的建立，药物筛选的系统的设计提供了新方法。体外获得NSC的最适合最方便的方法是利用多能干细胞诱导分化。
[0003]常用的两种多能干细胞是人诱导多能干细胞(hiPSC)和胚胎干细胞(ESC)。ESC来源于人胚胎细胞，这种细胞的获取由于伦理原因而变得困难。hiPSC通过体细胞重编程表达OCT3/4，SOX2，KLF4和c
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Myc而获得，它具有和胚胎干细胞相似的特征，使得hiPSC成为一个可替代ESC的细胞来源。虽然，hiPSC分化神经干性(iNSC)的方法已被广泛研究，但hiPSC获得的iNSC体外培养不稳定，细胞增殖能力丢失以及容易分化，阻碍了iNSC在研究和临床中的应用。因此，hiPSC诱导的iNSC的体外稳定传代培养成为亟需解决的问题。近些年，原代NSC体外长期稳定培养已被广泛研究。常用的永生化原代NSC的方法有体细胞融合，过表达c
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Myc，V
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Myc，SV40 large T antigen，或者改造端粒酶。这些方法可能会导致NSC丢失表型或者存在致癌性。
[0004]近些年以来，对调节干细胞自我更新的细胞内因子(TLX，Sox2，Hes，组蛋白修饰酶，染色体重塑蛋白，小RNA调节器)和细胞外信号分子(如Wnt，Notch，Shh，TGFα，EGF，FGF)已受到广泛关注。其中TLX(也称为NR2E1)是一种孤核受体，在成熟大脑中高表达，特别是SVZ区中的NSC，它对NSC自我更新，增殖和神经发生至关重要。TLX抑制Pten/LSDI，p21等蛋白来维持NSC的自我更新；通过调控SOX2的表达来维持NSC的增殖；此外，TLX可以通过调节Wnt7a，Mmp2，SIRT1等来调控神经发育。Murai等人用表达TLX的慢病毒感染海马体，证明了特异性表达TLX的海马体以自驱动的方式提高NSC的增殖，并促进海马体的神经发生，修复大脑的学习和记忆功能。虽然有报道称TLX过表达与胶质瘤相关，但是Li等人证明了过表达TLX会使神经胶质瘤干细胞的增殖和迁移能力下降，抑制肿瘤发生。
[0005]在NSC中过表达TLX，可能获得具备自我更新能力的NSC。现有hiPSC分化NSC的方法的分化周期长，且使用的试剂存在临床安全性问题，获得的NSC细胞阳性率低；并且hiPSC来源的NSC细胞体外无法长期稳定传代，批次间分化获得的NSC重复性低，不能保证足够的高纯度NSC供应用于TLX基因稳定转染表达操作。其他常见的将原代NSC改造为永生化NSC的方法有体细胞融合、过表达c
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Myc/V
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Myc或SV40 large T antigen，或者改造端粒酶。这些方法可能会导致NSC丢失表型或者存在致癌性。并且，原代NSC本身存在供体伦理争议的问题。因此，目前尚无法获得批次间稳定的规模化培养NSC。这一问题限制了神经系统疾病的细胞治疗，更无法获得大量的高质量的NSC源外泌体。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供过表达TLX的人诱导多能干细胞及其在分化获得永生化的NSC细胞中应用。
[0007]本专利技术提供了TLX在构建向NSC自驱动分化的hiPSC细胞中的应用；所述TLX包括如下I～IV中的至少一种：
[0008]I)、SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的TLX蛋白；
[0009]II)、在I)所述TLX蛋白的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与TLX蛋白具有相同或相近功能的蛋白；
[0010]III)、编码I)或II)所述蛋白的核酸分子；
[0011]IV)、在III)所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子；
[0012]V)、能够调控I)～V)中的至少一种的水平或活性的物质。
[0013]本专利技术还提供了SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的TLX蛋白，
[0014]或者，本专利技术提供了TLX蛋白的截短体。本专利技术所述截短体为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中缺失N端1～200个氨基酸的截短体。
[0015]一些实施例中，所述截短体为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的TLX蛋白截短体。
[0016]本专利技术还提供了编码TLX蛋白的核酸。或者本专利技术提供了编码所述截短体的核酸。
[0017]本专利技术实施例中，编码SEQ ID NO：1所示蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:3所示；编码SEQ ID NO：2所示蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0018]本专利技术还提供了一种转录单元，其包括启动子和本专利技术所述的核酸。
[0019]本专利技术中，所述启动子为CMV启动子或EF1A启动子。
[0020]本专利技术还提供了一种质粒载体，其包括骨架载体和本专利技术所述的转录单元。
[0021]本专利技术所述的质粒载体中，还可包括编码EGFP的核酸。
[0022]EGFP作为报告基因，便于培养效果或分化效果的观测，其表达对细胞生长、TLX的表达及效果发挥不产生影响。
[0023]本专利技术中，对所述骨架载体不做限定，经实验证明，本领域常用于iPSC细胞的质粒载体(例如各种常用的商品化的慢病毒、腺病毒载体，或含有整合酶Integrase的非病毒稳定转染表达载体)都可以用于本专利技术所述核酸序列的表达。
[0024]本专利技术还提供了一种宿主，其转染或转化有本专利技术所述的质粒载体。
[0025]本专利技术中所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、人肾上皮细胞系、昆虫细胞或hiPSC细胞。
[0026]本专利技术还提供了向NSC自驱动分化的hiPSC细胞，其表达本专利技术所述的核酸。即该hiPSC细胞中表达编码SEQ ID NO：1所示蛋白的核酸，或者表达编码SEQ ID NO：2所示截短体的核酸。
[0027]本专利技术所述向NSC自驱动分化的hiPSC细胞的构建方法包括：将所述的质粒载体和辅助质粒进行病毒包装，获得慢病毒后感染hiPSC细胞获得向NSC自驱动分化的hiPSC细胞。
[0028]本专利技术还提供了一种永生化NSC细胞，其由本专利技术所述向NSC自驱动分化的hiPSC细胞分化获得。
[0029]本专利技术还提供了一种hiPSC细胞分化为永生化NSC细胞的方法，其包括，将本专利技术
所述向NSC自驱动分化的hiPSC细胞经培养获得永生化NSC细胞。
[0030]本专利技术中促进hiPSC细胞分化为永生化NSC细胞的培养基，包括基础培养基和BSA、Glutamax添加剂、丙酮酸钠、NaCl、N2营养因子、B27神经营养因子和胰岛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.TLX在构建向NSC自驱动分化的hiPSC细胞中的应用；所述TLX包括如下I～IV中的至少一种：I)、SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的TLX蛋白；II)、在I)所述TLX蛋白的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与TLX蛋白具有相同或相近功能的蛋白；III)、编码I)或II)所述蛋白的核酸分子；IV)、在III)所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子；V)、能够调控I)～V)中的至少一种的水平或活性的物质。2.蛋白，其特征在于，为SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的TLX蛋白，或为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中缺失N端1～200个氨基酸的截短体。3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于，其为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的TLX蛋白截短体。4.编码权利要求2或3所述蛋白的核酸。5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，编码SEQ ID NO：1所示蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:3所示；编码SEQ ID NO：2所示蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。6.转录单元，其特征在于，包括启动子和权利要求4或5所述的核酸。7.根据权利要求6所述的转录单元，其特征在于，所述启动子为CMV启动子或EF1A启动子。8.质粒载体，其特征在于，包括骨架载体和权利要求6或7所述的转录单元。9.宿主，其特征在于，转染或转化有权利要求8所述的质粒载体。10.向NSC自驱动分化的hiPSC细胞，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伊，宋海峰，徐铭枝，陈刚，董亚南，薛苗苗，王丹枫，
申请(专利权)人：谛邈生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：