制备抗体偶联小分子药物的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种制备抗原结合片段偶联小分子药物的方法及其应用。本发明专利技术是一种改造人IgG Fc的方法，包括针对人IgG Fc的N端序列进行改造。所述方法获得的IgG Fc变体与抗原结合片段融合表达时，功能性分子负载量显著增加且表达后产生聚体的情况大大减少。本发明专利技术也揭示了包含该IgG Fc变体的融合蛋白、偶联药物等。等。等。

【技术实现步骤摘要】
制备抗体偶联小分子药物的方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术和药物学领域，更具体地，本专利技术涉及一种制备抗体偶联小分子药物的方法及其应用。

技术介绍

[0002]抗体偶联药物(antibody
‑
drug conjugate，ADC)是通过化学方法将抗体与小分子药物偶联到一起，利用抗体的靶向性，将小分子药物带到目标细胞，从而发挥药效。抗体偶联药物由于兼具抗体的靶向性以及小分子药物在肿瘤组织中高活性的双重优点，可高效杀伤肿瘤细胞，比传统的化疗药物副作用更低，也比传统的抗体类肿瘤药物具有更好的疗效，因此被称为肿瘤治疗领域的“生物导弹”，展示出了巨大的临床治疗价值，成为当前肿瘤治疗的研究热点。
[0003]目前大多数抗体偶联药物的偶联过程依赖于小分子药物与抗体中氨基酸残基采用随机或者定点的方式进行偶联，其中又以随机偶联方式为主。随机偶联的方式包括例如赖氨酸残基偶联和半胱氨酸残基偶联。赖氨酸残基偶联是利用抗体中的赖氨酸残基进行偶联，IgG分子中具有超过80个赖氨酸残基，其中溶剂可及性高的位点超过20个，这些赖氨酸残基均可通过酰化偶联小分子药物，但由于可以偶联的位点太多，容易导致每一批次的抗体偶联药物的产品异质性较大，药物抗体比(Drug to antibody ratio，DAR)分布不均，进而使研究抗体偶联药物的药物动力、药物代谢受到影响。半胱氨酸残基偶联是利用抗体中的半胱氨酸残基进行偶联，抗体表面一般不存在可以用于偶联反应的游离的半胱氨酸残基，其均以二硫键的形式存在。
[0004]人的IgG可以分为四种亚型，即 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，存在于其序列上链间二硫键的位置和分子量的不同，不同IgG亚型的Fc片段在结构和功能上也有所不同。目前上市和在研的绝大多数ADC均是常规的IgG，在IgG亚型选择方面，大多数采用人的IgG1亚型。
[0005]重链抗体最初发现于骆驼和鲨鱼类动物体内，是轻链天然缺失，只有重链组成的新型抗体分子。重链抗体和普通的抗体相比，虽然缺失了轻链，但是依然保留结合抗原的能力，同时还具有分子量小，易表达，易工程化改造，稳定性好等优点，正越来越多地被应用到抗体药物的开发中。但是，目前还没有利用重链抗体制备抗体偶联药物成功上市的报道。
[0006]利用重链抗体制备抗体偶联药物，将小分子药物通过半胱氨酸残基偶联到抗体上，如果采用人IgG1的Fc的话，可以利用链间二硫键是非常局限的，本领域中，一个ADC分子最多只能偶联4个小分子药物。而若是希望提高药效，就必须偶联更多的小分子药物，例如偶联6
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8个小分子药物。
[0007]因此，本领域亟待对于此类抗体偶联药物进行进一步的优化改造，以期提高携带小分子药物的量，提高药效。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种制备抗体偶联小分子药物的方法及其应用。
[0009]在本专利技术的第一方面，提供一种增加抗原结合片段
‑
人IgG Fc融合蛋白的功能性分子负载量且减少表达后聚体产生的方法，包括：(1)提供抗原结合片段
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人IgG Fc融合蛋白，所述人IgG Fc的N端序列为经改造的序列，所述改造为：将N端6
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15个(较佳地7
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13个或8
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12个)氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6 (ERKCCVECPPCP)所示的氨基酸残基，且基于该序列进行选自下组的改造：(a)在SEQ ID NO: 6序列的第4和第5位的CC两残基之间、之前(N端)或之后(C端)插入1
‑
9个氨基酸残基；(b)对SEQ ID NO: 6序列的第4或第5位任一C进行突变。
[0010]在一种或多种实施方式中，(a)中，在CC两残基之间插入2
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8个非半胱氨酸残基(较佳地插入2
‑
7个残基；更佳地为2
‑
4个残基)。
[0011]在一种或多种实施方式中，用于进行插入或突变改造的氨基酸残基包括：天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。
[0012]在一种或多种实施方式中，用于进行插入的氨基酸残基为酸性氨基酸，包括：天冬氨酸，谷氨酸，或其组合。
[0013]在一种或多种实施方式中，所述方法还包括：(2)在所述的抗原结合片段
‑
人IgG Fc融合蛋白上连接功能性分子；所述功能性分子的负载量为6
‑
8个。
[0014]在一种或多种实施方式中，所述功能性分子包括：小分子抗肿瘤药物，细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，基于嵌合抗原受体技术的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合。
[0015]在一种或多种实施方式中，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体。
[0016]在一种或多种实施方式中，所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素。
[0017]在一种或多种实施方式中，所述的可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物。
[0018]在一种或多种实施方式中，所述的抗肿瘤的毒素包括：作用于微管蛋白的毒素；作用于DNA的毒素；作用于细胞内代谢、转录、翻译或信号转导的化合物。
[0019]在一种或多种实施方式中，所述的抗肿瘤的细胞因子包括：IL
‑
2、IL
‑
12、IL
‑
15、IFN
‑
beta、TNF
‑
alpha或其变体。
[0020]在一种或多种实施方式中，所述的结合肿瘤表面标志物的抗体是识别肿瘤抗原的抗体。
[0021]在一种或多种实施方式中，所述作用于微管蛋白的毒素为单甲基澳瑞他汀、其相关化合物或其衍生物。
[0022]在一种或多种实施方式中，所述作用于微管蛋白的毒素为美登木素生物碱、其相关化合物或其衍生物。
[0023]在一种或多种实施方式中，所述作用于DNA的毒素为duocarmycin，calicheamicin，pyrrolobenzodiazepines，SN
‑
38，DXd、其相关化合物或其衍生物。
[0024]在一种或多种实施方式中，所述抗肿瘤的毒素与融合蛋白通过连接子连接，所述连接子包括：不可剪切的连接子；可剪切的连接子，包括基于二硫键的连接子，基于组织蛋
白酶敏感的连接子，基于腙键的连接子，基于溶酶体蛋白酶的连接子。
[0025]在一种或多种实施方式中，所述不可剪切的连接子为SMCC。
[0026]在一种或多种实施方式中，所述基于二硫键的连接子为sulfo
‑
SPDB。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增加抗原结合片段
‑
人IgG Fc融合蛋白的功能性分子负载量且减少表达后聚体产生的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提供抗原结合片段
‑
人IgG Fc融合蛋白，所述人IgG Fc的N端序列为经改造的序列，所述改造为：将N端6
‑
15个氨基酸残基替换为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸残基，且基于该序列进行选自下组的改造：(a)在SEQ ID NO: 6序列的第4和第5位的CC两残基之间、之前或之后插入1
‑
9个氨基酸残基；(b)对SEQ ID NO: 6序列的第4或第5位任一C进行突变。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)中，在CC两残基之间插入2
‑
8个非半胱氨酸残基。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用于进行插入或突变改造的氨基酸残基包括：天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸，或其组合。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，用于进行插入的氨基酸残基为酸性氨基酸，包括：天冬氨酸、谷氨酸，或其组合。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：(2)在所述的抗原结合片段
‑
人IgG Fc融合蛋白上连接功能性分子；所述功能性分子的负载量为6
‑
8个。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能性分子包括：小分子抗肿瘤药物，细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，基于嵌合抗原受体技术的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体；或所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素；或所述的可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的抗肿瘤的毒素包括：作用于微管蛋白的毒素；作用于DNA的毒素；作用于细胞内代谢、转录、翻译或信号转导的化合物；或所述的抗肿瘤的细胞因子包括：IL
‑
2、IL
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12、IL
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15、IFN
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beta、TNF
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alpha或其变体；或所述的结合肿瘤表面标志物的抗体是识别肿瘤抗原的抗体。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述作用于微管蛋白的毒素为单甲基澳瑞他汀、其相关化合物或其衍生物；或所述作用于微管蛋白的毒素为美登木素生物碱、其相关化合物或其衍生物；或所述作用于DNA的毒素为duocarmycin，calicheamicin，pyrrolobenzodiazepines，SN
‑
38，DXd、其相关化合物或其衍生物。10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人IgG选自：人IgG1，人IgG2或人IgG4；或所述的抗原结合片段包括：重链抗体，单链抗体，单域抗体，BiTE抗体，DART抗体，Fv抗体，Fd抗体中能与抗原结合的多肽；或
所述的抗原结合片段为抗体的重链或轻链的可变区，或两者的组合。11. 一种经改造的人IgG Fc变体，所述人IgG Fc的N端序列为经改造的序列，其N端6
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15个氨基酸残基被替换为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸残基，且基于该序列进行选自下组的改造：(a...

【专利技术属性】
技术研发人员：何虹霖，徐阳华，叶莉，冯梦婷，夏爱坤，钟子洋，
申请(专利权)人：上海偌妥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：