花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法技术

本发明专利技术公开了花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括：（１）培养基的配制；（２）花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养：１）供体植株与花蕾的选择；２）花蕾灭菌；３）花蕾预处理培养；４）花蕾小孢子的分离、混配与分装；５）小孢子胚状体的培养；６）再生植株的分化与萌发培养；７）再生植株的生根培养与移栽及８）再生植株的倍性检测。本发明专利技术显著提高了青花菜小孢子培养的出胚率、出苗率与再生植株的二倍体率，由常规的６０个胚／蕾、５０％与５０％左右分别提高为８０个胚／蕾、８０％及７０％以上，从而可提高花椰菜的育种效率。该方法可在蔬菜育种单位或企业中推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物组织培养
，特别是涉及一种花椰菜高二倍体率小 孢子再生植株的培养方法。
技术介绍
花椰菜(j5ra柳&o/eraceflL. var.6o^y似)因味道鲜美、营养丰富而在世界 各地普遍栽培。传统选育花椰菜杂交新品种的育种周期一般需6~8年，其中选 育亲本材料就需5~6年。利用小孢子培养方法能快速创制二倍体再生植株的亲 本材料，可显著提高育种效率，縮短育种周期至3 5年。以往国内外对花椰菜小孢子培养技术己有报道。1992年花椰菜小孢子培养 首获成功(DuijsJC,"a/.Euphytica, 1992, 60:45-55)，但出胚率较低。1999年在 培养基中加入活性碳后提高了小孢子的产胚率(Silva Dias JC. Euphytica, 1999, 108: 65-69)。国内也有花椰菜小孢子培养的报道(顾宏辉等，浙江大学学报(农 业与生命科学版)，2004, 30 (1): 34-38;顾宏辉等，浙江农业学报，2006， 18(5): 365-368;顾宏辉等，农业生物技术学报,2007, 15(2): 301-305;张晓芬等，中国蔬 菜，2005 (1): 16-17;方淑桂等，福建农业学报，2006, 21 (2): 138-142;赵前程等. 河南农业科学，2007(7): 77-79)。此外，2003年孙德岭等提出了"利用游离小孢子 培养技术培养花椰菜再生植株的方法"的专利技术专利申请(申请号03129987)， 但上述的研究报道和专利申请主要涉及了小孢子培养的胚胎发生与植株再生， 而并没有涉及如何提高花椰菜小孢子再生植株二倍体发生频率的方法。通过小孢子培养获得的花椰菜再生植株有单倍体、二倍体、四倍体及嵌合体等多种类型，除基因型差异外，二倍体的发生频率一般仅有50%左右，因而会明显降低小孢子培养育种的利用效率。但通过小孢子培养获得的二倍体植株是 纯合的，其性状稳定，后代性状不会分离。因此，寻求一种提高花椰菜小孢子 再生植株二倍体率的培养方法对育种来讲具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术目的是，针对现有花椰菜小孢子培养技术体系中所存在的再生植株 二倍体率低的缺陷，提供一种能提高花椰菜小孢子再生植株二倍体率的培养基 及培养方法，并以该高二倍体率的再生植株为育种亲本，进而达到提高花椰菜 育种进程与效率的目的。本专利技术目的通过以下技术方案来实现。，该方法按如下步骤进行-(1)培养基的配制包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组 分在每升培养基中所含重量为1) 花蕾预处理培养基NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L + 0.05~0.2%秋水仙碱+ l 3%DMSO， pH5.6~6.0，过滤灭菌；2) 胚状体诱导培养基NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L， pH5.6~6.0，过滤灭菌；3) 胚状体分化培养基B5液体培养基+trans-ZT0.5 2mg/L + IAA0.05 0.2 mg/L + BAP 0.5~2.0mg/L +木糖125~500mg/L +蔗糖或白糖20 30g/L+琼脂糖 2~5g/L， pH5.6 6.0,高温灭菌；4) 萌发、生根培养基85液体培养基+蔗糖或白糖20 3(^/1^+琼脂6 10 g/L， pH5.6 6.Q，高温灭菌；(2)花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养-1) 供体植株与花蕾的选择选择植株与花蕾生长健康的花椰菜作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在0.6-1.0之间，处于单核中晚期的花蕾；2) 花蕾灭菌用5.2。/。活性氯次氯酸钠50mL/L + 95。/。酒精100mL/L+吐温 20 100pL配制成灭菌液；在摇床上将花蕾放入灭菌液中进行表面消毒18分钟， 再在超净台上用无菌水清洗5次后，备用；3) 花蕾预处理培养将灭菌后花蕾置于花蕾预处理培养基上，在4。C下培 养1 5d;4) 花蕾小孢子的分离、混配与分装在超净台上将预处理培养后的花蕾置 于无菌烧杯中，加入IO mL胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾、搅成悬 浮液；将该悬浮液用40pm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，按1000rpm离心3 分钟，弃上清液；再加10mL胚状体诱导培养基按同样方法离心并弃上清液； 加入胚状体诱导培养基至平均每4mL培养基中含1.5个花蕾后，再按每4mL培 养基中加入由>^]^13液体培养基+琼脂糖2-58几+ lg/L活性炭配制、经高温 灭菌而成的活性炭混合液0.05mL的比例，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬 浮液分装于直径为6 mm或9 mm的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口 ，5) 小孢子胚状体的培养将分装好的培养皿置于31-33。C恒温培养箱中， 暗培养24-72小时；后置于25"C恒温培养箱，暗培养l-2周至胚状体出现；再在 25'C黑暗下50rpm振荡培养l-2周，至子叶型胚状体形成；6) 再生植株的分化与萌发培养在超净台中将子叶型胚状体，平放于半流 动的胚状体分化培养基上，在每天光照16小时、25'C下培养5-10d至胚状体膨 大并呈现浅绿色；后转移至相同条件下的萌发培养基中进行再生植株的萌发培养至形成新叶；7) 再生植株的生根培养与移栽切取萌发有正常生长点的再生植株插于生 根培养基中，在每天光照16小时、25。C下进行生根培养；将生根后的再生植株 移入含泥炭与珍珠岩按体积2 : l配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25'C 下培养l周；8) 再生植株的倍性检测取移栽成活再生植株的嫩叶，用partecPA倍性分 析仪检测该再生植株的DNA倍性；并从中选择出二倍体的再生植株作为亲本材 料用于育种。本专利技术的有益效果是1、 提高了花椰菜小孢子培养的出胚率，最高可达80个胚/蕾，对照为60 个胚/蕾；2、 提高了胚状体的出苗率，平均达80%，对照为50%;3、 提高了小孢子再生植株的二倍体率，平均二倍体再生植株数占总植株数 的70%以上，对照为50%左右。具体实施例方式通过以下实施例对本专利技术作进一步的详细说明，但本专利技术的内容并不局限 于此。实施例1:(1)该方法按如下步骤进行(1)培养基的配制包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组 分在每升培养基中所含重量为1)花蕾预处理培养基NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L + 0.P/。秋水仙碱 + 2%DMSO， pH5.6，过滤灭菌。其中NLN-13培养基配方见表1;2) 胚状体诱导培养基NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L， pH5.8,过滤灭菌；3) 胚状体分化培养基B5液体培养基+trans-ZT1.0mg/L + IAA0.1mg/L十 BAP1.0mg/L+木糖25011^/1^ +白糖30§/1^+琼脂糖3g/L， pH5.6，高温灭菌；其 中B5培养基配方见表1;4) 萌发、生根培养基85液体培养基+白糖30§/1>琼脂8g/L， pH6.0， 高温灭菌；表l NLN-13、 Bs培养基配方<table>table see original document page 8</column></row><table>(2)花椰菜高二倍体率本文档来自技高网...

【技术保护点】
花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：　（１）培养基的配制：包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中所含重量为：　１）花蕾预处理培养基：ＮＬＮ－１３液体培养基＋蔗糖或白糖 １３０ｇ／Ｌ＋０．０５～０．２％秋水仙碱＋１～３％ＤＭＳＯ，ｐＨ５．６～６．０，过滤灭菌；　２）胚状体诱导培养基：ＮＬＮ－１３液体培养基＋蔗糖或白糖１３０ｇ／Ｌ，ｐＨ５．６～６．０，过滤灭菌；　３）胚状体分化培养基：Ｂ５液体培养 基＋ｔｒａｎｓ－ＺＴ　０．５～２ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ　０．０５～０．２ｍｇ／Ｌ＋ＢＡＰ　０．５～２ｍｇ／Ｌ＋木糖１２５～５００ｍｇ／Ｌ＋蔗糖或白糖２０～３０ｇ／Ｌ＋琼脂糖２～５ｇ／Ｌ，ｐＨ５．６～６．０，高温灭菌；　４）萌发、生根培养基： Ｂ↓［５］液体培养基＋蔗糖或白糖２０～３０ｇ／Ｌ＋琼脂６～１０ｇ／Ｌ，ｐＨ５．６～６．０，高温灭菌；　（２）花椰菜高二倍体率小孢子再生植株的培养：　１）供体植株与花蕾的选择：选择植株与花蕾生长健康的花椰菜作为供体植株；并从中选择 花瓣与花药长度比在０．６－１．０之间，处于单核中晚期的花蕾；　２）花蕾灭菌：用５．２％活性氯次氯酸钠５０ｍＬ／Ｌ＋９５％酒精１００ｍＬ／Ｌ＋吐温２０　１００μＬ配制成灭菌液；在摇床上将花蕾放入灭菌液中进行表面消毒１８分钟，再在超净台上 用无菌水清洗５次后，备用；　３）花蕾预处理培养：将灭菌后花蕾置于花蕾预处理培养基上，在４℃下培养１～５ｄ；　４）花蕾小孢子的分离、混配与分装：在超净台上将预处理培养后的花蕾置于无菌烧杯中，加入１０ｍＬ胚状体诱导培养基，用平头玻棒 压碎花蕾、搅成悬浮液；将该悬浮液用４０μｍ无菌尼龙滤网过滤于离心管中，按１０００ｒｐｍ离心３分钟，弃上清液；再加１０ｍＬ胚状体诱导培养基按同样方法离心并弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每４ｍＬ培养基中含１．５个花蕾后，再按每４ｍＬ培养基中加入由ＮＬＮ－１３液体培养基＋琼脂糖２－５ｇ／Ｌ＋１ｇ／Ｌ活性炭配制、经高温灭菌而成的活性炭混合液０．０５ｍＬ的比例，混配成小孢子悬浮液；将该悬浮液分装于直径为６ｍｍ或９ｍｍ的无菌培养皿中，加盖后用ｐａｒａｆｉｌｍ膜封口，备用；　５ ）小孢子胚状体的培养：将分装好的培养皿置于３１－３３℃恒温培养箱中，暗培养２４－７２小时；后置于２５℃恒温培养箱，暗培养１－２...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：顾宏辉，朱丹华，虞慧芳，赵振卿，盛小光，王建升，张晓辉，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]