枳转录因子PtrTGA2及其在植物抗寒遗传改良中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域，公开了枳转录因子PtrTGA2及其在植物抗寒遗传改良中的应用，PtrTGA2基因是从极抗寒枳（Poncirus trifoliata）中分离、克隆出的转录因子，其序列为SEQ ID NO.1所示。将该基因分别构建超表达和干涉载体，并通过农杆菌介导的遗传转化将其分别导入柠檬和枳中，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明专利技术所克隆的PtrTGA2基因具有控制植物抗寒性的功能。该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

【技术实现步骤摘要】
枳转录因子PtrTGA2及其在植物抗寒遗传改良中的应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及枳转录因子PtrTGA2及其在植物抗寒遗传改良中的应用，申请人从枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆得到1个转录调控因子PtrTGA2，将该基因在不抗寒柠檬中超表达，获得的转基因植株抗寒性明显提高。

技术介绍

[0002]低温是限制作物生长发育及产量的重要环境因素，引起植物褪绿、生长发育受阻，甚至导致植株死亡。在微观层面则表现为低温引起植物体内ROS积累，造成氧化损伤、蛋白质失活变性，进而导致代谢紊乱、光合作用被抑制(Pearce 2001，Foyer et al 2002)。长时间零度以下的低温会引起细胞膜流动性变弱，细胞内冰晶形成，破坏细胞结构，细胞内容物流出，最终导致细胞死亡(Steponkus 1984)。植物通过改变代谢通路基因的表达及积累大量的保护物质(包括脯氨酸、甜菜碱、多胺及可溶性糖等)，以抵御低温带来的伤害，这些抗冻物质通过稳定细胞渗透压，维持低温下的细胞结构、保持细胞膜流动性、促进ROS清除来发挥作用(Kaplan and Guy 2004，Chinnusamy et al 2007，Baier et al 2019，Chai et al 2019)。
[0003]转录因子是植物生长发育、逆境响应等生命活动中重要的调控者，通过蛋白
‑
蛋白互作、或靶向调节下游基因表达来行使功能(Zhu et al 2016)。同时，转录因子也可能受其他转录因子调控，或者被蛋白激酶活化/抑制。大量研究发现，转录因子通过调控低温诱导的COR基因，参与植物的逆境应答(Klepikova et al 2019，Wu et al 2021)。
[0004]bZIP(basic leucine zipper)转录因子家族具有高度保守的bZIP结构域及亮氨酸拉链结构域的典型特征。作为一个庞大的转录因子家族，bZIP家族的各个成员在植物的生长发育以及应对非生物胁迫中发挥着重要的作用(Jakoby and Vicente
‑
carbajosa 2002)。已经多个物种中发现了bZIP家族基因调控低温逆境应答。DgbZIP2/DgbZIP2通过激活DgPOD增强菊花的抗寒性(Bai et al 2022)。除了积极的正调控作用，bZIP转录因子也被发现负调控低温抗性，bZIP68在玉米驯化过程中，启动子区域缺失了一个358bp的片段，导致bZIP68的表达增加，玉米的耐寒性降低(Li et al 2022)。还有研究发现，bZIP家族转录因子HY5(LONG HYPOCOTYL 5)与MYB15
‑
CBFs构成转录级联在番茄低温响应中起重要作用(Zhang et al2020)，HY5还被证实能够激活赤霉素GA失活酶GA2ox4和ABA合酶SlNCED6的表达，通过不同激素信号协同调控植物在低温下的生长(Catal
á
et al 2011)。CmABF1(Abscisic acid responsive element
‑
binding factor 1)通过CmADC(Arginine decarboxylase，精氨酸脱羧酶)介导的腐胺合成正调控甜瓜的耐寒性(Li et al 2022)。
[0005]TGA(TGACG
‑
BINDING FACTOR)基因是植物bZIP转录因子家族的重要成员，在植物的免疫响应中起着主导的调控作用。因其通过启动子上TGACG保守序列的activation sequence
‑
1(as
‑
1)元件调控靶基因而得名(Garret
ó
n et al 2002)。TGA基因与SA介导的病原菌信号通路紧密相关，SA信号的转导依赖于TGA转录因子(Fan and Dong 2002)。当植物受到病原菌侵染时，体内的水杨酸快速积累，水杨酸受体NPR1进入细胞核与TGA蛋白结合，
共同激活下游防御相关的PRs基因(Kinkema et al 2000)。在拟南芥tga2 tga5 tga6三突变体中，SA诱导的PRs表达不能被激活(Zander et al 2014，Qi et al 2022)。除了在生物胁迫中发挥着至关重要的作用，TGA亚家族成员TGA2、TGA5、TGA6还能通过调控GSTU(glutathione S
‑
transferase Tau subfamily)基因提高ROS清除能力以应对UV胁迫(Herrera
‑
V
á
squez et al 2021)。除了传导SA信号，还有研究发现TGA基因可以直接或间接地影响内源SA的水平。OsTGA5可以作为一个负调控因子，通过抑制内源SA的积累，减弱对稻瘟病抗性相关基因转录来降低抗病性(Niu et al 2022)。过表达水稻OsTGAL1影响了SA代谢途径基因的转录，降低了内源SA水平，导致了对病原菌的敏感性增强(Li et al 2022)。然而，TGA转录因子在低温响应方面的研究仍鲜少报道，因此，解析TGA转录因子的低温抗性作用机制，对作物抗寒育种具有重要价值。
[0006]由于柑橘植物低温抗性较弱，因此低温是限制柑橘栽培地理分布的主要因素，解析柑橘逆境响应机制，并以此为理论基础培育抗寒品种、开发生产中应用的抗冻保护剂成为了柑橘育种研究的当务之急。枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)作为目前我国最常见的柑橘砧木，低温驯化后可以耐
‑
26℃，被认为是挖掘抗寒基因的重要资源。因此，分离并鉴定枳抗寒相关基因是丰富柑橘抗逆基因资源库，及揭示枳低温抗性机制的关键和基础。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的在于提供了枳转录因子PtrTGA2，所述的枳转录因子PtrTGA2为SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术另一目的在于提供了枳转录因子PtrTGA2在控制植物抗寒性状中的应用。将该基因在植物中超表达或沉默表达，可获得抗寒能力增强或减弱的植株。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施
[0010]申请人基于植物基因克隆技术从枳中克隆得到一个新基因PtrTGA2，其中PtrTGA2基因编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示，核苷酸为SEQ ID NO.1所示，该基因包含1233bp的开放阅读框，编码410个氨基酸，等电点为6.78，预测的分子量为45.49kDa。
[0011]表达SEQ ID NO.2所示蛋白的物质也为本专利技术的保护范围，所述的物质为含有编码SEQ ID NO.2的多核苷酸的表达框，重组载体或重组微生物。
[0012]本专利技术的保护范围还包括：
[0013]SEQ ID NO.2所示蛋白、编码SEQ ID NO.2所示蛋白的多核苷酸或表达SEQ ID NO.2所示蛋白的物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种从枳（Poncirus trifoliata）中分离出的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。2.编码权利要求1所述蛋白质的多核苷酸。3. 根据权利要求2所述的序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。4. 表达SEQ ID NO.2所示蛋白的物质，所述的物质为含有编码SEQ ID NO.2的多核苷酸的表达框，重组载体或重组微生物。5.权利要求1所述的蛋白、权利要求2所述的多核苷酸或权利要求4所述的物质在控制植物抗寒性中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，所述的植物为枳或柠檬。7. 根据权利要求6所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘继红，肖玮，李春龙，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：