验证RNA异常剪接的方法及试剂盒技术

本申请提供了一种验证RNA异常剪接的方法和试剂盒，该方法包括如下步骤：针对目的基因的突变位点设计sgRNA和ssODN；采用所述sgRNA和所述ssODN，通过CRISPR/Cas9构建点突变细胞系；提取所述点突变细胞系的总RNA，以所述总RNA为模板进行RT

【技术实现步骤摘要】
验证RNA异常剪接的方法及试剂盒


[0001]本申请涉及分子生物学
，特别是涉及一种验证RNA异常剪接的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]单基因遗传病是指由单个基因的致病变异引起的疾病。迄今为止，已在人类中确定了7000多种单基因疾病，在新生儿疾病和儿科住院疾病中分别占5.3％和10％，对人类健康构成了极大的威胁。
[0003]明确遗传病因对于单基因疾病的治疗至关重要。目前，在临床实践中通常采用全外显子组测序(WES)或基因panel来确定单基因疾病的潜在遗传原因(致病或可能的致病变异)。然而，在相当大比例的病例中发现了许多意义不明变异(variant of uncertain significance,VUSs)；在ClinVar数据库中也记载了48％的变异意义不确定。这些VUSs(包括错义、沉默和内含子变异)给遗传咨询和临床管理带来了相当大的困难。因此，需要更多的功能学证据解读VUSs。
[0004]据报道，约15％的引起人类疾病的点突变会破坏前体mRNA的剪接，导致基因异常剪接。因此，当临床医生高度怀疑变异与表型相关时，有必要进一步对VUS进行解读；明确这些VUSs的致病性可以帮助医生制定医疗决策，提高临床诊断率，并对生殖干预产生深远影响。根据ACMG/AMP(American College of Medical Genetics and Genomics/Association for Molecular Pathology)的指导方针，对异常剪接进行实验验证比in silico analysis的结果更准确可靠。
[0005]基于来自血液或其他组织的RNA样本进行剪接分析的前提是：相应的基因在这些样本中表达。然而，在临床实践中往往无法从相关样本中提取患者RNA，如从大脑和卵巢组织中提取RNA。Minigene分析可以在体外复制剪接模式，一定程度上弥补了这种无法获得患者RNA进行功能学分析的不足；Minigene技术又称为mRNA异常剪接体外验证实验，是一项针对突变位点是否影响mRNA剪接的细胞水平验证实验；通过克隆带有变异位点(包括剪切位点附近以及深度内含子中的点突变、插入及缺失等变异类型)的目标基因组片段，构建重组表达载体，转染细胞株，RNA抽提及cDNA反转，再利用电泳和测序技术验证该突变对mRNA剪接的影响(如外显子缺失、内含子滞留等)。
[0006]在进行Minigene分析时，需要将突变位点邻近的多个外显子、内含子整段扩增出来，并将这些序列构建到外源启动子的载体上；因此，该方法只能针对内含子小且无大量重复序列的片段。而前体mRNA剪接是个十分复杂的过程，只分析特定的几个外显子可能无法正确反应突变对剪接的影响。

技术实现思路

[0007]基于此，本申请提供了一种适用性广、准确高效、更接近真实情况的验证RNA异常剪接的方法及试剂盒。
[0008]根据本申请的一个方面，提供了一种验证RNA异常剪接的方法，包括如下步骤：
[0009]针对目的基因的突变位点设计sgRNA和ssODN；
[0010]采用所述sgRNA和所述ssODN，通过CRISPR/Cas9构建点突变细胞系；
[0011]提取所述点突变细胞系的总RNA，以所述总RNA为模板进行RT
‑
PCR，获取扩增产物；以及
[0012]对所述扩增产物进行测序分析，验证所述点突变是否影响RNA剪接。
[0013]在其中一个实施例中，所述目的基因的突变位点为PKHD1基因c.8951
‑
130A>G。
[0014]在其中一个实施例中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0015]在其中一个实施例中，所述目的基因的突变位点为PKHD1基因c.8798
‑
459C>A。
[0016]在其中一个实施例中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017]在其中一个实施例中，构建点突变细胞系包括如下步骤：
[0018]在所述sgRNA序列的两端加入酶切位点，合成寡核苷酸链；
[0019]将所述寡核苷酸链与其反向互补链退火形成双链DNA；
[0020]所述双链DNA与使用线性内切酶消化的Cas9载体连接，构建Cas9/sgRNA表达载体；以及
[0021]将所述Cas9/sgRNA表达载体和所述ssODN共同转染宿主细胞，制备点突变细胞系。
[0022]在其中一个实施例中，所述酶切位点为BbsI酶切位点。
[0023]在其中一个实施例中，所述Cas9载体可选自pSpCas9(BB)
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2A
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Puro、pU6
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(BbsI)_CBh
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Cas9
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T2A
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BFP、SpCas9
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HF1或eSpCas9(1.1)。
[0024]根据本申请的另一个方面，提供了一种验证RNA异常剪接的试剂盒，所述试剂盒包括sgRNA、ssODN、Cas9载体和测序试剂中的一种或多种。
[0025]在其中一个实施例中，所述试剂盒满足如下条件(1)～(2)中的一种：
[0026](1)所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0027](2)所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0028]与传统相比，本申请具有如下有益效果：
[0029]本申请首次采用CRISPR/Cas9技术构建点突变的细胞系、结合测序分析的方法，对基因突变是否影响RNA剪接进行分析。CRISPR/Cas9系统是一种简单、高效的基因编辑技术，基于该系统可以实现对任何突变位点的功能学验证；并且，该系统是针对细胞本身基因组DNA进行修饰，可以更好的模拟复杂的剪接事件，特别是外显子包含或外显子跳跃的情况。采用本申请的方法验证基因突变是否导致RNA异常剪接，具有适用性广、操作便捷、准确高效等特点。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的
motif)序列附近剪切DNA形成DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)，随后可以利用同源重组修复机制将外源模板中的突变信息引入基因组DNA中。SpCas9(Streptococcus pyogenes Cas9)是目前使用最多的Cas9核酸内切酶，PAM序列为NGG。
[0048]WES(w本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种验证RNA异常剪接的方法，其特征在于，包括如下步骤：针对目的基因的突变位点设计sgRNA和ssODN；采用所述sgRNA和所述ssODN，通过CRISPR/Cas9构建点突变细胞系；提取所述点突变细胞系的总RNA，以所述总RNA为模板进行RT
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PCR，获取扩增产物；以及对所述扩增产物进行测序分析，验证所述点突变是否影响RNA剪接。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的基因的突变位点为PKHD1基因c.8951
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130A>G。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的基因的突变位点为PKHD1基因c.8798
‑
459C>A。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，构建点突变细胞系包括如下步骤：在所述sgRNA序列的两端加入酶切位点，合成寡核苷酸链；将所述寡核苷酸链与其反向互补...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢春波，程德华，何文斌，肖文娟，杜娟，谭跃球，
申请(专利权)人：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司，
类型：发明
国别省市：