柑橘CsPIF4基因及其编码的蛋白与应用制造技术

本发明专利技术涉及植物分子生物学领域，具体涉及一个类胡萝卜素代谢相关的CsPIF4基因及其编码的蛋白质和应用。所述基因的CDs序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。本发明专利技术中所述CsPIF4基因在茎、叶、花和不同发育时期的果实中均有表达，果实中CsPIF4表达量最低，且随果实成熟而不断下降，与类胡萝卜素积累呈显著的负相关关系。通过农杆菌介导的柑橘瞬时转化法将PHB

【技术实现步骤摘要】
柑橘CsPIF4基因及其编码的蛋白与应用


[0001]本专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及一个柑橘CsPIF4基因、其编码的蛋白和应用。

技术介绍

[0002]类胡萝卜素是自然界中广泛分布的一类次生代谢物，对植物生理和人体健康发挥着重要作用。对于植物而言，类胡萝卜素赋予植物组织丰富多彩的颜色，参与植物光合作用和光保护过程，抵御生物和非生物逆境胁迫。对于人类而言，类胡萝卜素能提供维生素A的合成前体，帮助机体增强免疫力、减少癌症等各种疾病的发生。柑橘是世界上第一大果树，其果实中的类胡萝卜素多达115种以上，而且，柑橘起源于我国及东南亚地区，在我国有悠久的栽培历史，存在着丰富的色泽变异类型以及突变体资源。因此，柑橘果实类胡萝卜素代谢基因的分子调控机制研究具有重要意义。
[0003]光敏色素作用因子PIF基因作为细胞内的一个信号中心，能整合多种环境因子和内部信号，在植物次生代谢中起重要作用。PIF1直接负调控PSY基因影响拟南芥种子颜色；成熟番茄果实中SlPIF4的沉默使果实内类胡萝卜素累积量显著提高；PIFs主要通过特异性抑制类胡萝卜素代谢途径的重要限速酶PSY基因的表达，进而减少类胡萝卜素的积累。目前，PIF同源基因的研究主要集中在模式植物拟南芥和番茄中。但是，柑橘作为世界上第一大果树，尚无有关其PIF同源基因的研究报道。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术的目的是提供柑橘CsPIF4基因及其编码的蛋白与应用。
[0005]首先，本专利技术提供柑橘CsPIF4蛋白，其为：
[0006]1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或
[0007]2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质，其中，所述的由1)衍生的蛋白质包括bHLH结构域以及APB结构域。
[0008]本专利技术还提供编码所述的柑橘CsPIF4蛋白的基因。
[0009]优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。
[0010]本专利技术还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。
[0011]本专利技术还提供所述基因在调控果实色泽和营养品质中的用途。
[0012]在本专利技术一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超表达，使所述植物的果实类胡萝卜素积累水平降低。
[0013]在本专利技术一个具体实施方案中，所述植物为柑橘或番茄。
[0014]本专利技术还提供一种降低果实类胡萝卜素含量的方法，其为将含有所述基因的载体转入植物基因组中，并在转基因植株中超量表达，从而降低果实中类胡萝卜素的含量。
[0015]本专利技术首次从柑橘果实中克隆了1个调控类胡萝卜素代谢的CsPIF4基因，通过实
时荧光定量PCR证实了CsPIF4在果实中的表达水平，与类胡萝卜素积累呈显著的负相关关系，利用植物基因工程的手段在柑橘果实中瞬时过表达，在番茄植株中稳定超表达，能降低果实类胡萝卜素积累水平，为柑橘果实色泽和营养品质的改良提供了很好的应用前景。
附图说明
[0016]图1为柑橘CsPIF4基因ORF的PCR产物。
[0017]图2为本专利技术中CsPIF4基因所编码蛋白质的氨基酸序列、结构域和基序划分图。
[0018]图3是柑橘CsPIF4基因在柑橘的茎、叶、花和不同发育时期的果实表达量。
[0019]图4为CsPIF4基因在转基因柑橘果实中的表达分析。
[0020]图5为CsPIF4转基因番茄植株的阳性鉴定。PCR鉴定农杆菌转化的植株依次为CsPIF4
‑
OE1、2、3、4、6和WT。
[0021]图6为三个稳定超表达CsPIF4番茄株系果实在花后三十(30DAB)和四十天(40DAB)表型与野生型的差异。
[0022]图7为稳定超表达CsPIF4番茄果实中类胡萝卜素含量测定。
具体实施方式
[0023]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0024]实施例中所使用的试剂主要包括分子生物学实验试剂、耗材和试剂盒等，均可通过商业途径获得，具体包括：RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Biospin全能型植物基因组DNA提取试剂盒购自杭州博日科技有限公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；SMARTer PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、Max DNA Polymerase、T
‑
Vector pMD
TM
19(Simple)、BamHI和SpeI购自TaKaRa(宝生物工程(大连))有限公司；引物合成和测序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。本专利技术实施例中所提供的方法如果没有特殊说明均为常规方法。
[0025]实施例1柑橘CsPIF4基因全长的克隆
[0026]以柑橘果实为原料，使用RNAprep Pure Plant Plus Kit试剂盒提取柑橘果实总RNA。以总RNA为模板使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒合成第一链cDNA。
[0027]使用Max DNA Polymerase(R045A，Takara)扩增CsPIF4全长开放阅读框(ORF)，具体步骤如下：以甜橙基因组(Csi_valencia_1.0,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000317415.1)中CsPIF4(LOC102626817)序列信息设计扩增引物。以柑橘cDNA为模版，上游特异性引物CsPIF4
‑
F：5
’‑
ATGAATCCATGCATCCCTGAT
‑3’
,下游特异性引物CsPIF4
‑
R：5
’‑
CTAACCCATCTTGCCACTTAG
‑3’
，按98℃ 3min，98℃ 10sec，58℃ 10sec，72℃ 5sec/kb,72℃ 5min，2
‑
4步循环38次进行扩增。随后利用1％琼脂糖凝胶电泳(图1)，按SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(B518131，Sangon Biotech)说明书步骤进行回收。回收PCR产物，连接到pMD19
‑
T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，送样测序，柑橘CsPIF4 cDNA的全长序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
MES，10mM MgCl2，200μmol/L AS，pH＝5.6)悬浮菌体，用于转基因。
[0039]以...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.柑橘CsPIF4蛋白，其为：1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质，其中，所述的由1)衍生的蛋白质包括bHLH结构域以及APB结构域。2.编码权利要求1所述的柑橘CsPIF4蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。4.含有权利要求2或3所述基因的载体。5.含有权利要求4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：席万鹏，杨灿，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：