使用荧光和化学发光标记两者的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测液体样品中的分析物的免疫测定方法；并为高浓度和低浓度两种样品提供准确性和再现性。该方法使用荧光标记和化学发光标记两者，并读取荧光信号和化学发光信号两者。使用预先建立的分析物浓度值，基于荧光信号的校准曲线或化学发光信号的校准曲线来确定分析物浓度。曲线来确定分析物浓度。曲线来确定分析物浓度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用荧光和化学发光标记两者的检测方法


[0001]本专利技术涉及使用荧光和化学发光标记两者来检测液体样品中的分析物的方法。双标记提供对高浓度和低浓度两种样品的准确定量。

技术介绍

[0002]抗原抗体对、受体配体对和互补核苷酸对通常用作诊断测试中的检测基础。固定在基底上以捕获样品中的靶标的抗体、互补核酸或受体通常称为捕获分子。在捕获分子与样品中的靶标分析物结合后，使用检测抗体、核酸或受体来检测所捕获的靶标分析物。检测抗体、核酸或受体可在其上具有荧光、化学发光或电化学发光标记，以提供检测信号。
[0003]在这些标记中，通常使用荧光分子。然而，在诊断检测中，样品中靶标分子的数目变化很大，并且它们的浓度变化至少5,000倍；对于某些特定靶标，浓度变化甚至超过300,000倍。尽管荧光标记可有效地检测具有低端浓度的靶标，但是当靶标浓度较高时，荧光标记的浓度可增加若干数量级。当荧光分子彼此靠近时，将发生自淬灭，这导致荧光信号与靶标浓度之间的非线性关系，并且导致定量不准确。
[0004]化学发光标记无需外部辐射能就能进行检测。能量来自于化学反应打破化学键之后释放的光子。然而，化学发光标记的能量转换效率不是1 00％。大量能量通过热耗散而不是产生光子。当分析物浓度低时，化学发光免疫测定通常显示出测定变异。
[0005]仍然需要改进的检测方法来解决免疫测定中遇到的问题。
附图说明
[0006]图1示出了用于从探头的感测表面检测荧光信号和化学发光信号两者的光学检测系统。
具体实施方式<br/>[0007]定义
[0008]权利要求和说明书中使用的术语应根据本领域技术人员所理解的它们的通常含义来解释，除了如下所述的定义之外。
[0009]如本文所用，
″
约
″
是指在所述值的
±
10％内。
[0010]如本文所用，
″
分析物结合分子
″
是指能够参与与分析物分子的特异性结合反应的任何分子。
[0011]形状的
″
纵横比
″
是指其较长尺寸与其较短尺寸的比率。
[0012]″
结合分子
″
是指能够结合另一个感兴趣的分子的分子。
[0013]如本文所用，
″
结合对
″
是指彼此吸引并且彼此特异性结合的两个分子。结合对的示例包括但不限于抗原和针对抗原的抗体、配体及其受体、核酸的互补链、生物素和亲和素、生物素和链霉亲和素、生物素和中性亲和素(亲和素的去糖基化形式)、凝集素和碳水化合物。优选的结合对是生物素和链霉亲和素、生物素和亲和素、生物素和中性亲和素、荧光
素和抗荧光素、地高辛/抗地高辛、DNP(二硝基苯酚)/抗DNP。
[0014]如本文所用，
″
化学发光
″
是指作为化学反应的结果，具有有限发光发射的能量发射。例如，当鲁米诺(1umin01)与过氧化氢在合适的催化剂存在下反应时，其产生激发态的3
‑
氨基邻苯二甲酸酯，当其衰减至较低能级时发光。
[0015]如本文所用，
″
固定
″
是指试剂被固定到固体表面。当试剂固定到固体表面时，它非共价结合或者共价结合到表面。
[0016]如本文所用，
″
单片基底
″
是指单片固体材料。
[0017]如本文所用，
″
探头
″
是指在感测侧涂覆有分析物结合分子薄膜层的基底。探头具有远端和近端。近端(在本申请中也指探头尖端)具有涂覆有分析物结合分子薄层的感测表面。优选地，基底具有低荧光背景，并且基底可以是石英、硅、金属、陶瓷或塑料。
[0018]本专利技术改进了用于测量分析物浓度的荧光检测方法，例如，如美国公开号201I/0312105中所述。本专利技术方法除了在该方法中使用荧光标记外，还使用化学发光标记。荧光检测提供了针对低浓度分析物的灵敏度和准确性，并且化学发光检测提高了高浓度分析物的准确性。
[0019]在本专利技术的检测方法中，使用荧光标记和化学发光标记两者。首先读取荧光信号，以获得低端灵敏度和精确性的优点。然后读取化学发光信号。当荧光信号高且接近饱和时，化学发光信号提供靶标分析物的准确高端浓度。
[0020]第一方面
[0021]在第一方面，本专利技术涉及检测液体样品中的分析物的方法。该方法包括以下步骤：(a)将探头尖端浸入样品溶液中以使若存在的分析物与探头尖端上的第一抗体结合，其中探头具有固定在探头尖端上的第一抗体；(b)将探头尖端浸入包含生物素缀合的第二抗体的试剂溶液中，以在探头尖端上的分析物、第一抗体和第二抗体之间形成免疫复合物，其中第一抗体和第二抗体是各自针对分析物的两种不同抗体；(c)将探头尖端浸入洗涤溶液中；(d)将探头尖端浸入包含用荧光标记物标记的链霉亲和素和用化学发光标记物标记的链霉亲和素的溶液中；(e)将探头尖端浸入读取容器中，并测量结合在探头尖端上的材料的荧光信号；(f)基于荧光信号对照第一校准曲线对分析物浓度进行定量；(g)将探头尖端浸入触发溶液中，以生成结合在探头尖端上的材料的化学发光信号；(h)基于化学发光信号对照第二校准曲线对分析物浓度进行定量，以及(i)根据分析物的荧光信号，使用预先建立的截止值，基于荧光信号对照第一校准曲线或基于化学发光信号对照第二校准曲线确定分析物浓度。
[0022]在步骤(a)中，探头可以是任何形状，诸如杆状、圆柱形、圆形、正方形、三角形等。在一个实施方案中，探头具有至少5比1，或10比1的长宽比。优选杆状。
[0023]探头具有用于结合分析物的小尖端。尖端具有较小的表面积，其中直径≤5mm，优选地≤2mm或≤1mm，例如0.5mm至2mm。
[0024]探头尖端涂覆有与样品中的分析物结合的第一抗体。将试剂固定到固相(探头尖端的感测表面)的方法在免疫化学中是常见的，并且涉及在固相与试剂之间形成共价键、疏水键或静电键。第一抗体可以直接固定在感测表面上。或者，第一抗体可通过结合对间接固定在感测表面上。例如，可通过吸附到固体表面或通过共价结合到涂覆在固体表面上的氨基丙基硅烷来首先固定抗荧光素。然后，用荧光素标记的第一抗体可通过荧光素和抗荧光
素的结合(结合对)而结合到固体表面。
[0025]将探头尖端浸入样品容器中20秒至60分钟，优选20秒至10分钟，以使分析物与探头尖端上的第一抗体结合。
[0026]在步骤(a)之后，任选地将探头在含有洗涤溶液的洗涤容器中洗涤1至5次，优选1至3次。可能不需要该额外的洗涤步骤，因为由于结合表面积小，残留溶液的量很少。洗涤溶液通常含有缓冲液和表面活性剂诸如Tween 20。
[0027]在步骤(b)中，将探头尖端浸入试剂容器中20秒至10分钟，优选20秒至2分钟，以结合针对分析物的生物素缀合的第二抗体，从而形成免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测液体样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将探头尖端浸入样品溶液中以使若存在的分析物与所述探头尖端上的第一抗体结合，其中所述探头具有固定在所述探头的所述尖端上的第一抗体；(b)将所述探头尖端浸入包含与结合对的第一成员缀合的第二抗体的试剂溶液中，以在所述探头尖端上的所述分析物、所述第一抗体和所述第二抗体之间形成第一免疫复合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体是各自针对所述分析物的两种不同抗体；(c)将所述探头尖端浸入洗涤溶液中；(d)将所述探头尖端浸入包含(i)用荧光标记进行标记的结合对的第二成员和(ii)用化学发光标记进行标记的结合对的所述第二成员的溶液中，以在所述探头尖端上形成具有所述荧光标记的第二免疫复合物和具有所述化学发光标记的第三免疫复合物；(e)将所述探头尖端浸入读取容器中，并测量结合在所述探头尖端上的所述第二免疫复合物的荧光信号；(f)基于所述荧光信号对照第一校准曲线对所述分析物浓度进行定量；(g)将所述探头尖端浸入触发溶液中，以生成来自结合在所述探头尖端上的所述第三免疫复合物的化学发光信号；(h)基于所述化学发光信号对照第二校准曲线对所述分析物浓度进行定量，以及(i)基于所述荧光信号或所述化学发光信号确定所述分析物浓度。2.一种检测液体样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)混合包含样品、与半抗原缀合的第一抗体、与结合对的第一成员缀合的第二抗体的溶液，其中所述第一抗体和所述第二抗体是各自针对所述分析物的两种不同抗体；(b)将探头尖端浸入(a)的所述溶液中，以在所述探头尖端上的所述分析物、所述第一抗体和所述第二抗体之间形成第一免疫复合物；(c)将所述探头尖端浸入洗涤溶液中；(d)将所述探头尖端浸入包含(i)用荧光标记进行标记的结合对的第二成员和(ii...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈浩德，吴衡，谭洪，罗伯特，
申请(专利权)人：万迈医疗仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：