肌红蛋白突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及肌红蛋白突变体及其应用。本发明专利技术所述的肌红蛋白突变体源自抹香鲸肌红蛋白，含有13个突变位点。本发明专利技术实验证明，本发明专利技术提供的肌红蛋白突变体失去了对血红素的结合能力，能够有效结合大框架卟啉，应用前景良好。应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】
肌红蛋白突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及肌红蛋白突变体及其应用。

技术介绍

[0002]肌红蛋白是一种小分子蛋白质，其分子结果与血红蛋白相似，具有在肌细胞内转运和贮存氧的功能。人体心肌、骨骼肌内含有大量肌红蛋白，正常人的血液中很少，主要由肾脏代谢并排泄。当心肌或横纹肌有损伤时，肌红蛋白便释放入血中，血清中的肌红蛋白即可明显升高。
[0003]肌红蛋白广泛存在于生物体内，它是由一条肽链和血红素辅因子折叠而成的色素蛋白，其中，血红素(铁原卟啉)在肌红蛋白发挥功能时扮演重要角色。
[0004]肌红蛋白的三级结构呈紧密球形。多肽链中氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部,亲水侧链多位于分子表面,因此其水溶性较好。肌红蛋白有8段α
‑
螺旋区每个α
‑
螺旋区含7～24个氨基酸残基，分别称为A、B、C
…
G及H肽段。有1～8个螺旋间区，肽链拐角处为非螺旋区(亦称螺旋间区)，包括N端有2个氨基酸残基，C端有5个氨基酸残基的非螺旋区，处在拐点上的氨基酸残基Pro、Ile、Ser、Thr、Asn等极性氨基酸分布在分子表面。内部存在一口袋形空穴，血红素居于此空穴中。血红素是铁卟啉化合物，它由4个吡咯通过4个甲炔基相连成一个大环，Fe
2+
居于环中。
[0005]铁与卟啉环及多肽链氨基酸残基的连接:铁卟啉上的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连。血红素的Fe
2+
与4个咯环的氮原子形成配位键，另2个配位键1个与F8组氨酸结合，1个与O2结合，故血红素在此空穴中保持稳定位置。这种构象非常有利于运氧和储氧功能，同时也使血红素在多肽链中保持稳定。
[0006]近年来，研究者利用多种方法对含有血红素蛋白的辅因子进行替换，生成人工金属卟啉蛋白，用于催化高价值反应。目前能够实现将肌红蛋白的铁原卟啉替换为其他金属原卟啉或具有类似大小的金属卟啉框架，但无法实现大卟啉框架的高效替换，限制了人工金属卟啉蛋白的发展与应用。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了肌红蛋白突变体及其应用，从而实现肌红蛋白的铁原卟啉与大框架卟啉的高效替换。
[0008]本专利技术提供肌红蛋白突变体，该突变体的突变位点包括：
[0009]第30位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；
[0010]第33位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；
[0011]第69位氨基酸残基由缬氨酸突变为丙氨酸；
[0012]第73位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；
[0013]第76位氨基酸残基由异亮氨酸突变为丙氨酸；
[0014]第77位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；
[0015]第104位氨基酸残基由酪氨酸突变为丝氨酸；
[0016]第105位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；
[0017]第108位氨基酸残基由异亮氨酸突变为丙氨酸；
[0018]第112位氨基酸残基由异亮氨酸突变为丙氨酸；
[0019]第136位氨基酸残基由亮氨酸突变为丙氨酸；
[0020]第139位氨基酸残基由苯丙氨酸突变为丙氨酸；
[0021]第143位氨基酸残基由异亮氨酸突变为丙氨酸。
[0022]本专利技术提供的肌红蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0023]本专利技术还提供了编码所述肌红蛋白突变体的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。在本专利技术一些实施例中，所述核酸分子由定点突变技术引入突变，之后纯化回收得到相应片段，并用Gibson Assembly进行片段连接得到。
[0024]本专利技术还提供包含所述核酸分子的载体。在本专利技术一些实施例中，所述载体的骨架载体为大肠杆菌表达载体pET28a。
[0025]本专利技术还提供了包含所述核酸分子或所述载体的菌株。在本专利技术一些实施例中，所述菌株为DH5α。在本专利技术另一些实施例中，所述菌株为BL21(DE3)。
[0026]本专利技术提供编码肌红蛋白突变体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体及包含上述两者任意项的菌株在制备可结合金属卟啉蛋白中的应用。所述应用包括将所述编码肌红蛋白突变体的核酸分子插入载体，将所述载体转化至所述菌株，之后对所述菌株进行诱导表达。在一些实施例中，所述诱导表达所用培养基为含50μg/mL卡那抗生素的LB培养基，所用诱导剂为IPTG。
[0027]本专利技术提供肌红蛋白突变体及编码所述肌红蛋白突变体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述核酸分子及所述载体的菌株在制备金属卟啉蛋白和/或酶中的应用。
[0028]本专利技术提供金属卟啉蛋白，所述蛋白包括肌红蛋白突变体和金属卟啉。在一些实施例中，所述金属卟啉包括四苯基卟啉氯化锰(Ⅲ)、5,10,15,20
‑
四(五氟苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)或5,10,15,20
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四(2,4,6
‑
三甲基苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)。
[0029]本专利技术实验证明，本专利技术提供的抹香鲸肌红蛋白突变体失去了对血红素的结合能力，能够有效结合大框架卟啉，应用前景良好。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0031]图1示肌红蛋白质突变体结合四苯基卟啉氯化锰(Ⅲ)的光谱表征，其中灰色表示肌红蛋白突变体的吸收光谱图，黑色表示肌红蛋白突变体结合四苯基卟啉氯化锰(Ⅲ)的吸收光谱图，约在470nm处出现最高吸收，表明肌红蛋白突变体成功结合；
[0032]图2示肌红蛋白质突变体结合5,10,15,20
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四(五氟苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的光谱表征，其中灰色表示肌红蛋白突变体的吸收光谱图，黑色表示肌红蛋白突变体结合5,10,15,20
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四(五氟苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的吸收光谱图，约在448nm处出现最高吸收，表明肌红蛋白突变体成功结合；
[0033]图3示肌红蛋白质突变体结合5,10,15,20
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四(2,4,6
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三甲基苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的光谱表征，其中灰色表示肌红蛋白突变体的吸收光谱图，黑色表示肌红蛋白突变体结合5,10,15,20
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四(2,4,6
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三甲基苯基)卟啉氯化锰(Ⅲ)的吸收光谱图，约在470nm处出现最高吸收，表明肌红蛋白突变体成功结合。
具体实施方式
[0034]本专利技术公开了肌红蛋白突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.肌红蛋白突变体，其特征在于，包括以下任意突变：L30A；和/或L33A；和/或V69A；和/或L73A；和/或I76A；和/或L77A；和/或Y104S；和/或L105A；和/或I108A；和/或I112A；和/或L136A；和/或F139A；和/或I143A。2.如权利要求1所述肌红蛋白突变体，其特征在于，具有如下所示氨基酸序列的任意项：I、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或II、如I所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基获得，且与I所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或III、与如I或II所示的氨基酸序列具有至少90％同源性，且与I或II所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。3.编码如权利要求1或2所述肌红蛋白突变体的核酸分子，其特征在于，具有如下所示核苷酸序列的任意项：I、如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或II、与I所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与I所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或III、如I或II所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得，且与I或II所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或IV、与如I所示的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗云孜，黄超群，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：