本发明专利技术涉及一种基于瞬间稳态上转换荧光传感器同时检测鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法。首先将水溶性上转换材料封装在空心圆柱体中制成上转换荧光比色皿。接着构建荧光传感器，包括磁性氧化石墨烯、特异性识别鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的适配体以及酶修饰物。通过测定荧光信号，建立两种目标菌的检测标准曲线。该方法可实现鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌含量的测定。本发明专利技术通过制备的上转换荧光比色皿提高材料的重复利用率和检测结果的准确性，同时利用磁性氧化石墨烯材料简化操作过程，降低成本，利用酶催化技术提高传感器的灵敏度。该检测方法具有较宽的线性检测范围和较低的检测限，具有良好的应用前景。好的应用前景。好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种基于瞬间稳态上转换荧光传感器同时检测鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法及装置
[0001]本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及一种基于瞬间稳态上转换荧光传感器的鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌同时检测方法及装置。
技术介绍
[0002]沙门氏菌和金黄色葡萄球菌作为两种常见的食源性致病菌，广泛存在于食品和环境当中。可以通过食物进入消费者体内，从而引起伤寒、败血症和急性肠胃炎等多种疾病。鸡肉是沙门氏菌和金黄色葡萄球菌感染人的主要媒介之一。鸡肉是禽肉的重要组成部分，具有高营养、低胆固醇、低脂肪以及廉价等优点，是一种良好的营养素来源。与此同时，鸡肉也成为了微生物天然的培养基。鸡肉在屠宰、加工、包装、运输、销售等过程中容易受到食源性致病菌以及腐败菌等微生物的污染。因此，鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测显得十分重要。
[0003]传统的食源性致病菌检测方法有平板计数法、免疫学方法(如酶联免疫吸附法)、分子增扩检测方法(如PCR、环介导等温扩增技术和滚环扩增技术等)。这些检测技术普遍存在着检测时间长、设备昂贵、检测成本高、检测灵敏度不高和容易出现假阳性等缺点。为了解决上述检测技术在食源性致病菌检测难题，一些基于荧光传感器的快速检测技术被开发用于食品中微生物快速检测。这些检测方法在食品安全检测的应用上展现了快速、准确、高选择性、低成本等优点，但这些检测技术仍然存在一些不足，如高背景信号干扰，检测信号不稳定等。因此开发一种灵敏，高选择性的新型食源性致病菌检测方法，来进一步提高食源性致病菌检测技术。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于克服现有的检测技术的存在的技术缺陷，如：检测灵敏度低、检测材料的重复利用率低、检测效率低。本专利技术提供了一种基于瞬间稳态上转换荧光传感器同时检测鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法及装置，具体通过自主设计的上转换荧光比色皿、辣根过氧化物酶标记的适配体修饰和碱性磷酸酶标记的适配体修饰的磁性氧化石墨烯，构建高灵敏的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测荧光传感器，提高检测材料的重复利用率以及检测结果准确性，实现鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的高灵敏、高特异性检测。
[0005]为了实现以上目的，本发阿明的具体步骤如下：
[0006]步骤一，油溶性上转换材料的制备：将六水氯化铒、六水氯化钇、六水氯化镱和六水氯化钆加入到甲醇中超声，超声溶解后，转移到装有油酸和十八烯的三口烧瓶中，在氮气和磁力搅拌下升温，进行第一次反应，反应结束后逐滴加入氟化铵和氢氧化钠的混合溶液，升温并进行第二次反应，反应结束后再升温，使反应液的甲醇完全挥发，反应结束后，在磁力搅拌和氮气的保护下继续升温，进行第三次反应，反应结束后，冷却至室温后，得到反应
产物，用环己烷和乙醇的混合溶液对反应产物进行清洗，真空烘箱下烘干得到油溶性上转换纳米颗粒。
[0007]步骤二：阿仑膦酸修饰上转换合成：将第一步得到的上转换纳米材料加入到乙醇和三氯甲烷的混合溶液中，超声使其分散，转移至装有阿仑膦酸溶液的离心管中，在磁力搅拌下加入盐酸溶液，调节pH进行反应，反应结束后，用乙醇
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水的混合溶液进行清洗，真空干燥，得到阿仑膦酸修饰的上转换纳米材料。
[0008]步骤三：上转换荧光比色皿的制备：将步骤二得到的上转换纳米颗粒加入到空心的圆柱体中，进行封口，将实心的长立方体柱和装有上转换纳米颗粒封口的圆柱体嵌入常量的比色皿中，制得上转换荧光比色皿。
[0009]步骤四：磁性氧化石墨烯的制作：将氧化石墨烯加入到去离子水中，超声使其完全分散，随后加入二氯化铁和三氯化铁。将混合溶液加热至85℃。随后加入氢氧化铵溶液并在85℃下反应50分钟，反应结束后利用去离子水清洗3次，制得磁性氧化石墨烯材料。
[0010]步骤五：荧光比传感器的构建：将步骤四得到的磁性氧化石墨烯溶液分别与辣根过氧化物酶标记的适配体和碱性磷酸酶标记的适配体溶液第一次反应。反应后得到两种酶标记的适配体修饰的磁性氧化石墨烯，然后分别将TMB显色液和BCIP/NBT显色液加入到两种酶标记的适配体修饰的磁性氧化石墨烯溶液当中；反应后转移到上转换荧光比色皿内，制得上转换荧光传感器。
[0011]步骤六：鼠伤寒沙门氏菌检测标准曲线的建立：分别加入不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌溶液到步骤五得到的上转换荧光传感器当中，得到检测溶液，测定检测溶液的上转换荧光强度信号值；以鼠伤寒沙门氏菌浓度为横坐标，以547nm处上转换荧光强度差值为纵坐标，建立鼠伤寒沙门氏菌检测标准曲线。金黄色葡萄球菌检测标准曲线的建立：分别加入不同浓度的金黄色葡萄球菌溶液到步骤五得到的上转换荧光传感器当中，得到检测溶液，测定检测溶液的上转换荧光强度信号值。以金黄色葡萄球菌浓度为横坐标，以658nm处上转换荧光强度差值为纵坐标，建立金黄色葡萄球菌检测标准曲线。
[0012]步骤七：鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测：将鸡肉置于无菌操作台上剪碎，然后加入装有无菌水的均质袋中，混匀后静置，取上清液后，得到检测溶液。测定检测溶液的荧光传感器荧光强度，带入步骤六得到的鼠伤寒沙门氏菌的标准曲线和金黄色葡萄球菌的标准曲线，计算出鸡肉中的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌含量。
[0013]优选的，步骤一中，所述六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化铒、六水氯化钆、甲醇A的用量比为0.087g∶0.047g∶0.005g∶0.066g∶3mL；所述超声溶解的时间为5
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10min；所述第一次加热搅拌反应，温度为140
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180℃，时间为30min；所述第二次加热搅拌反应，温度为280
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320℃，时间为1h；
[0014]优选的，步骤二中所述甲醇A、油酸和1
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十八烯的体积比为3∶4.5∶10.5；所述油酸包覆的上转换材料、水、乙醇、三氯甲烷和阿仑膦酸的用量比为100mg∶3mL∶2mL∶4mL∶24.9mg；所述的HCl浓度为1mol/L；超声分散的时间为10
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20min。所述的水
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乙醇的混合溶液的体积比为1∶1。
[0015]优选的，步骤三中所述的圆柱立方体的底面半径为2.5mm，高度为12.5mm，所述的上转换浓度为1
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2mg/mL；所述的实心立方体住的高度为20cm，底面边长为12.5cm。
[0016]优选的，步骤四中，所述氧化石墨烯∶二氯化铁∶三氯化铁∶氢氧化铵的质量比为
0.8∶25.3mg∶16.2mg∶0.7mg，所述的超声时间为30min，所述的反应时间为50min。
[0017]优选的，步骤五中，所述的磁性氧化石墨烯溶液、辣根过氧化物酶标记的适配体与碱性磷酸酶标记的适配体体积比为100∶100∶100，所述的浓度比为0.625mg/mL∶0.4mM∶0.5mM；所述第一次反应时间为5min所述的TM3显色也的体积为100μL；所述的BCIP/NBT显色液的体积为100本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于瞬间稳态上转换荧光传感器同时检测鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：制备得到油酸包覆的上转换纳米材料；步骤二：将步骤一得到的油酸包覆的上转换纳米材料加入到乙醇
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三氯甲烷的混合溶液当中，超声分散，加入阿仑膦酸溶液，进行第一次磁力搅拌反应，加入盐酸并调节pH到2
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3，进行第二次磁力搅拌反应，反应结束后，得到反应产物，用水
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乙醇混合溶液清洗，真空烘箱干燥，得到阿仑膦酸修饰的上转换纳米材料。步骤三：上转换荧光比色皿的制作：将步骤二得到的阿仑膦酸修饰的上转换纳米材料封装在空心的圆柱体内，将一个实心的立方体柱和装有上转换纳米材料的圆柱体嵌入比色皿中，制作成封装有上转换荧光纳米颗粒的荧光比色皿。步骤四：磁性氧化石墨烯的制作：将氧化石墨烯加入到去离子水中，超声使其完全分散，随后加入二氯化铁和三氯化铁。将混合溶液加热至85℃。随后加入氢氧化铵溶液并在85℃下反应50分钟，反应结束后利用去离子水清洗3次，制得磁性氧化石墨烯材料。步骤五：荧光传感器的构建：将步骤四得到的磁性氧化石墨烯溶液与辣根过氧化物酶标记的适配体、碱性磷酸酶标记的适配体溶液第一次反应，反应后得到两种酶标记的适配体修饰的磁性氧化石墨烯，然后分别将TMB显色液和BCIP/NBT显色液加入到适配体修饰的磁性氧化石墨烯溶液当中，反应后转移到上转换荧光比色皿内，制得上转换荧光传感器。步骤六：鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测标准曲线的建立：分别加入不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌溶液和金黄色葡萄球菌溶液到步骤五得到的上转换荧光传感器当中，得到检测溶液。测定检测溶液的上转换荧光强度信号值，分别以鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌浓度为横坐标，以上转换荧光强度信值差值为纵坐标，建立鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测标准曲线。步骤七：鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测：将鸡肉置于无菌操作台上剪碎，然后加入装有无菌水的均质袋中，混匀后静止，取上清液后，得到检测溶液，测定检测溶液下荧光传感器的荧光强度，带入步骤六得到的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的标准曲线，计算出鸡肉中的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌含量。2.根据权利要求1所述的一种基于瞬间稳态上转换荧光传感器的鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌同时检测方法，其特征在于，步骤二中，所述油酸包覆的上转换材料、水、乙醇、三氯甲烷和阿仑膦酸的用量比为100mg∶3mL∶2mL∶4mL∶24.9mg；所述的HCl浓度为1mol/L；超声分散的时间为10
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20min。3.根据权利要求1所述的一种基于瞬间稳态上转换荧光传感器同...
【专利技术属性】
技术研发人员：屠康，陈敏，宋雅琪，韩璐，严钟煜，潘磊庆，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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