一种靶向编辑mtDNA的CRISPR-Cas9递送载体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种靶向编辑mtDNA的CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种靶向编辑mtDNA的CRISPR
‑
Cas9递送载体的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药的
，尤其是涉及一种靶向编辑mtDNA的CRISPR
‑
Cas9递送载体的制备方法。

技术介绍

[0002]线粒体是为细胞提供能量（ATP）的细胞器，一个线粒体中一般有多个DNA分子，人类线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是长16569bp的环状双链分子，分轻链和重链，含37个基因，主要编码呼吸链及与能量代谢有关的蛋白。mtDNA缺失或点突变使编码线粒体氧化代谢过程必需的酶或载体发生障碍，糖原和脂肪酸等不能进入线粒体充分利用和产生足够的ATP，导致能量代谢障碍和产生复杂的临床症状。线粒体疾病是以线粒体功能异常为显著特征的一类重大疾病，如Leber遗传性视神经病变、线粒体肌病等。线粒体疾病常由细胞核基因突变和线粒体DNA（mtDNA）突变引起，特别地，由mtDNA突变引起的线粒体疾病常在母体传播，从而导致一系列无法治愈的遗传性代谢疾病，危害十分严重。
[0003]转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator
‑
like effector nuclease, TALEN）技术与锌指核酸酶（zinc
‑
finger nuclease, ZFN）技术组成了一大类强有力的基因组编辑工具，这一大类技术的发展重新划定了生物学研究的边界。这些嵌合核酸酶由两部分组成——一个可编码的序列特异性DNA结合模块与一个非特异性的DNA切割结构域。通过诱导DNA双链断裂（DNA double
‑
strand break）来刺激容易出错的非同源末端连接或在特定基因所在的位置进行的同源定向修复，TALEN和ZFN能够完成一系列遗传学编辑修饰操作。采用ZFN和TALEN加上线粒体定位信号，可以实现对突变mtDNA的切割，但是该方法制备繁琐复杂，组装成本高且时间长，具有很大局限性。
[0004]成簇规律间隔短回文重复（clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat, CRISPR）技术是最新出现的一种基因组编辑工具，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。与其它基因组编辑工具相比，CRISPR技术更易于操作，具有更强的可扩展性。其中，CRISPR
‑
Cas9系统结构简单，可快捷且高效地介导对目的DNA的精准编辑，在推广应用方面具有极大优势（P. A. Gammage, C. T. Moraes and M. Minczuk, Trends in Genetics, 2018, 34: 101
‑
110）。然而，由于外源RNA难以高效进入线粒体内，而CRISPR
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Cas9系统主要通过sgRNA引导Cas9蛋白进行特异性切割，所以利用该系统进行mtDNA精准编辑存在一定难度，尤其是对癌细胞上的mtDNA靶向编辑，有待改进。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的问题是针对现有技术中所存在的上述不足而提供一种靶向编辑mtDNA的CRISPR
‑
Cas9递送载体的制备方法，其解决了现有CRISPR
‑
Cas9系统对mtDNA编辑不精准的问题，达到了精准编辑mtDNA、尤其是癌细胞上的mtDNA的效果。
[0006]本专利技术的上述专利技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种靶向编辑mtDNA的CRISPR
‑
Cas9递送载体的制备方法，包括以下步骤，
S1将Cas9蛋白和sgRNA混合，得到Cas9
‑
sgRNA复合物；其中，所述sgRNA包含以SEQ ID No:1所示的核苷酸序列、和/或与SEQ ID No:1具有至少85%同源性的核苷酸序列；S2所述Cas9
‑
sgRNA复合物、原硅酸四乙酯、以及双
‑
[3
‑
（三乙氧基硅）丙基]‑
二硫化物在有机溶剂中，于氨水存在下进行反应，反应结束后经后处理，得到包覆可降解硅层的Cas9
‑
sgRNA复合物；S3在水中，所述包覆可降解硅层的Cas9
‑
sgRNA复合物和3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷进行反应，反应结束后经后处理，将反应物依次经过三苯基膦修饰和透明质酸修饰，得到递送载体。
[0007]进一步地，所述递送载体包括所述Cas9
‑
sgRNA复合物、包覆于所述Cas9
‑
sgRNA复合物上的可降解硅层、以及化学修饰于所述可降解硅层表面的透明质酸基团和三苯基膦基团。
[0008]更进一步地，提供所述递送载体在哺乳动物细胞内编辑mtDNA的应用，所述细胞包括过表达CD44的人宫颈癌细胞HeLa和人正常肝细胞LO
‑
2。
[0009]进一步地，在所述S1中，sgRNA的核苷酸序列包含以SEQ ID No:1所示的核苷酸序列、和/或与SEQ ID No:1具有至少85%同源性的核苷酸序列的n个重复的序列，n≥1。
[0010]更进一步地，所述n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、24或32，其中，当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。
[0011]更进一步地，所述sgRNA的核苷酸序列为与SEQ ID No:1具有至少88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同源性的核苷酸序列。
[0012]进一步地，在所述S1中，控制Cas9蛋白和sgRNA的质量比为1：（0.8~1.2）。
[0013]进一步地，在所述S2中，控制Cas9
‑
sgRNA复合物、原硅酸四乙酯、双
‑
[3
‑
（三乙氧基硅）丙基]‑
二硫化物和氨水的质量比为（10~14）：（3~5）：（7~9）：（5~7）。
[0014]更进一步地，在所述S2中，先将曲拉通X
‑
100、正己醇和环己烷搅拌混合1~2min，得到混合溶剂，再滴加Cas9
‑
sgRNA复合物、原硅酸四乙酯和双
‑
[3
‑
（三乙氧基硅）丙基]‑
二硫化物的混合溶液，搅拌后加入氨水，继续搅拌反应12~16h，反应结束后，依次经过丙酮沉淀、离心分离、洗涤沉淀、烘干沉淀的后处理，得到包覆可降解硅层的Cas9
‑
sgRNA复合物。
[0015]最进一步地，在所述S2中，控制曲拉通X
‑
100、正己醇和环己烷的体积比为1：（0.8~1.2）：（3.5~4.5）。
[0016]进一步地，在所述S3中，控制包覆可降解硅层的Cas9
‑
sgRNA复合物和3...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向编辑mtDNA的CRISPR
‑
Cas9递送载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，S1将Cas9蛋白和sgRNA混合，得到Cas9
‑
sgRNA复合物；其中，所述sgRNA包含以SEQ ID No:1所示的核苷酸序列、和/或与SEQ ID No:1具有至少85%同源性的核苷酸序列；S2所述Cas9
‑
sgRNA复合物、原硅酸四乙酯、以及双
‑
[3
‑
（三乙氧基硅）丙基]
‑
二硫化物在有机溶剂中，于氨水存在下进行反应，反应结束后经后处理，得到包覆可降解硅层的Cas9
‑
sgRNA复合物；S3在水中，所述包覆可降解硅层的Cas9
‑
sgRNA复合物和3
‑
氨丙基三乙氧基硅烷进行反应，反应结束后经后处理，将反应物依次经过三苯基膦修饰和透明质酸修饰，得到递送载体。2.根据权利要求1所述的一种靶向编辑mtDNA的CRISPR
‑
Cas9递送载体的制备方法，其特征在于：所述递送载体包括所述Cas9
‑
sgRNA复合物、包覆于所述Cas9
‑
sgRNA复合物上的可降解硅层、以及化学修饰于所述可降解硅层表面的透明质酸基团和三苯基膦基团。3.根据权利要求1所述的一种靶向编辑mtDNA的CRISPR
‑
Cas9递送载体的制备方法，其特征在于：在所述S1中，控制Cas9蛋白和sgRNA的质量比为1：（0.8~1.2）。4.根据权利要求1所述的一种靶向编辑mtDNA的CRISPR
‑
Cas9递送载体的制备方法，其特征在于：在所述S2中，控制Cas9
‑
sgRNA复合物、原硅酸四乙酯、双
‑
[3
‑
（三乙氧基硅）丙基]
‑
二硫化物和氨水的质量比为（10~14）：（3~5）：（7~9）：（5~7）。5.根据权利要求4所述的一种靶向编辑mtDNA的CRISPR
‑
Cas9递送载体的制备方法，其特征在于：在所述S2中，先将曲拉通X
‑
100、正己醇和环己烷搅拌混合1~2min，得到混合溶剂，再滴加Cas9
‑
sgRNA复合物、原硅酸四乙酯和双

【专利技术属性】
技术研发人员：葛璟燕，钱慧娟，蒋林冶，周必重，温清霞，檀维，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：