近江牡蛎体内抗人类肿瘤HL60的sTRAIL蛋白质及其引物制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，旨在提供近江牡蛎体内抗人类肿瘤ＨＬ６０的ｓＴＲＡＩＬ蛋白质及其引物。该蛋白质具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示的氨基酸序列；编码该蛋白质的基因具有ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１所示的核苷酸序列本发明专利技术还用于扩增权利要求２所述蛋白质的基因的寡聚核苷酸引物。本发明专利技术利用基因工程技术开发的牡蛎中ｓＴＲＡＩＬ蛋白质产品，对ＨＬ６０肿瘤细胞具有杀伤性强、特异性高、安全性好、能够大量生产、易于贮存等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种近江牡蛎体内抗人类肿瘤急性早幼粒白血病细胞株 (HL60)的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可溶性细胞因子蛋白质及其引物。
技术介绍
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand， TRAIL), 又称为凋亡素2配体(AP02 ligand， AP0-2L) (Wiley et al,, 1995; Pitti et al, ， 1996)， 其胞外结构域在金属蛋白酶的作用下，可降解形成可溶性的细胞因子sTRAIL (Soluble TRAIL ) ， sTRAIL具有TRAIL的生物学功能(Bodmer et al., 2000) 。 TRAIL是TNF超家族 中一类重要的跨膜细胞因子(Wiley et al. ， 1995; Pitti et al. ， 1996)，可选择性地引起人 类大多数肿瘤细胞发生细胞凋亡包括脑、肾、肝、肺、胃、结肠、乳腺、前列腺、胰腺、 胆管、宫颈、皮肤和造血系统来源的肿瘤细胞，而对正常细胞无或仅具有极低的毒性(Dphil， 2007 :马远方，2007)。我国是水产大国，牡蛎等贝类养殖是我国海水养殖的支柱产业之一。根据联合国粮农组 织(FA0)的数字显示，我国每年牡蛎的产量具全世界首位，达到300多万吨(湿重)，占 我国海洋水产养殖总产量(约1000万吨)的约三分之一。牡蛎不仅肉质细嫩、肉味鲜美、 营养价值高，还具有抗癌降血脂等功效，有"海洋牛奶"之美誉，是世界性的水产佳肴。目 前国内外通过提取牡蛎等贝类体内的多糖等生物活性物质，并开发出了保健食品。但以上多 为多糖等物质的混合物，是免疫调节产品，并且基础研究资料少，对肿瘤细胞的毒性作用较 低，对其功效及副作用等所知不多。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术提供了一种近江牡蛎中肿瘤坏死因子相关凋亡 诱导配体可溶性细胞因子蛋白质及其引物。为达到以上目的，本专利技术是通过这样的技术方案来实现的提供一种近江牡蛎体内抗急性早幼粒白血病细胞株(HL60)的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可溶性细胞因子蛋白质， 具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。本专利技术还提供了一种编码前述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种用于扩增前述蛋白质的基因的寡聚核苷酸引物，其结构为TRAILf: 5' -GTGAGAGAAAGAG-3， TRAILr: 5' -TTAGCCAACTTAAAAG-3'。 本专利技术的有益效果在于本专利技术利用基因工程技术开发的牡蛎中sTRAIL蛋白质产品，对HL60肿瘤细胞具有杀伤 性强、特异性高、安全性好、能够大量生产、易于贮存等优点。具体实施例方式本专利技术的下述实施例所使用分子生物学的方法均为已知的技术。本专利技术中，近江牡蛎sTRAIL蛋白质即肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可溶性细胞因子 蛋白质，简称CasTRAIL,其中Ca代表近江牡蛎，sTRAIL代表肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配 体可溶性细胞因子；HL60即急性早幼粒白血病细胞株。本专利技术的实现步骤包括1、 以近江牡蛎cDNA为模板，设计扩增sTRAIL蛋白质基因的引物，获得编码sTRAIL蛋 白质的基因全序列。2、 利用DNA重组技术将sTRAIL基因片段克隆到合适的pMD19-T载体(购自Takara公 司，日本)中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-28(a)原核表达载体(购自 Novagen公司，美国)相连接，获得表达载体pET-28a(+)-sTRAIL。3、 sTRAIL蛋白质的体外诱导表达，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹 (Western blot)等方法鉴定目的蛋白质。4、 利用亲和柱分离纯化目的蛋白质，获得重组的sTRAIL蛋白质。5、 培养急性早幼粒白血病细胞株HL-60 (购买自中国科学院上海细胞生物研究所，中国)，添加纯化的近江牡蛎sTRAIL (CasTRAIL)重组蛋白质，培养细胞0-24小时。6、 分别收集细胞，利用以下两种方法鉴定HL60细胞的凋亡用流式细胞仪检测 凋亡率；提取DNA检测DNA ladder的形成。具体的操作步骤如下 1、引物设计与合成设计用于扩增sTRAIL蛋白质基因的寡聚核苷酸引物为 TRAILf: 5， -GTGAGAGAAAGAG-3， ( SEQ ID NO: 3) TRAILr: 5' -TTAGCCAACTTMAAG-3， ( SEQ ID NO: 4)。2、 PCR扩增与表达载体的构建以近江牡蛎cDNA为模板扩增目的片段，PCR扩增的反应条件为94t:预变性3分钟； 35个循环94°C 30秒钟，56°C 30秒钟，72°C 45秒钟；72°C IO分钟。PCR产物连入pMD19-T 载体，转化大肠杆菌JM109 (购自Takara公司，日本)，涂布含氨苄青霉素的LB筛选平板， 挑若干个克隆进行酶切和PCR鉴定，选一阳性克隆扩大培养，以碱法抽提质粒.将制备好的 质粒以vWel和限制性内切酶(购自Takara公司，日本)双酶切，连入经过同样双酶 切的pET-28a(+)载体的相应位点上，转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Tiangen公司，德国)。 PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET-28a(+)-sTRAIL。经上述方式获得来自于近江牡蛎体内特有的sTRAIL蛋白质(CasTRAIL)，该蛋白质具有 SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列；编码该蛋白质的基因具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序 列。3、 重组蛋白质的表达与鉴定将阳性重组质粒pET-28a(+)-sTRAIL转化表达宿主菌BL21感受态，涂布含卡那霉素的LB平板，37'C培养过夜。挑取一个单克隆菌落，转入LB培养液，37'C振摇培养过夜。取适 量菌液，按1:100扩大培养至OD,为0.4-0.5时，将菌液分为若干等份，不加或分别加入 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(购自Sangon公司，加拿大)，使其终浓度在0-1. 0 mmol/L， 继续培养6小时，离心收集细菌。细菌经超声波裂解后，离心分离上清液和沉淀，分别上样， 进行SDS-PAGE电泳。4、 重组蛋白质的纯化与抗体制备利用组氨酸亲和层析柱对表达产物进行分离纯化。以上述方法大量制备超声裂解的菌 液，离心分离上清液，进行蛋白质的纯化和洗脱操作，并采用12%的SDS-PAGE进行鉴定。挑选体重约1.5 kg的健康新西兰白雄兔进行免疫。经过一次初始免疫和两次加强免疫 后，颈动脉取血，分离血清，存储于-80。C。5、 蛋白质定量与抗体效价的检测按Brad-ford法对蛋白质进行定量(Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein_dye binding. Anal Biochem. 1976， 72: 248-254)。免疫后的兔血清用ELISA方法检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种近江牡蛎体内抗人类肿瘤ＨＬ６０的ｓＴＲＡＩＬ蛋白质，其特征在于，具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴信忠，杨受保，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]