番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用及转基因植物培育方法技术

本发明专利技术公开了一种番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用及转基因植物培育方法，所述双生病毒为番茄黄曲叶病毒，SlSUVH2和SlSUVH4基因的转录本序列如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用及转基因植物培育方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用以及抑制番茄黄曲叶病毒侵染的转基因植物培育方法。

技术介绍

[0002]番茄黄曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)属于双生病毒科，菜豆金色花叶病毒属，是目前研究最多的植物病毒之一，同时也是对全球番茄生产危害最大的病毒。流行时可造成农作物的产量和品质下降，对农业经济造成严重损失。
[0003]TYLCV在自然界中主要通过烟粉虱进行传播，传播TYLCV的烟粉虱主要有B型和Q型，并且Q型烟粉虱的传毒效率比B型高。除了介体传播外，TYLCV可以通过嫁接传播。TYLCV侵染植物后会使植物生长缓慢，造成植株矮化，还会使叶片卷曲、黄化和皱缩。
[0004]农业卫生预防是生产中控制TYLCV的重要措施。然而，由于该病毒具有高度传染性，这就使得农业卫生措施预防病毒成为挑战，尤其是在密集的大田和保护地，该病毒发生严重，造成番茄大量减产或者绝收。虽然目前生产上有一些抗TYLCV的植物遗传材料，但是TYLCV变异速度快、传播介体爆发以及田间经常发生复合侵染原因等，导致这些抗性材料对TYLCV的抗性常常被病毒所突破。因此，目前还没有有效控制TYLCV的方法，急需通过研究获得高效、广谱的抗双生病毒的抗性靶标和抗性资源。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一目的是提供一种番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用。
[0006]本专利技术的第二目的是提供一种番茄SlSUVH2或SlSUVH4转基因植物的培育方法。
[0007]本专利技术发现了番茄中SlSUVH2和SlSUVH4基因是抗病基因，通过农杆菌转化的方法，将SlSUVH2或SlSUVH4基因导入目的植物中，获得的番茄SlSUVH2或SlSUVH4高表达的番茄植物能够显著减轻TYLCV的侵染，有效控制该病毒的危害。
[0008]具体而言，本专利技术采用的技术方案具体如下：
[0009]番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用，其中，所述双生病毒为番茄黄曲叶病毒。所述SlSUVH2和SlSUVH4基因的转录本序列如SEQ ID NO:1
‑
2所示。
[0010]具体的，是通过农杆菌转化的方法，将SlSUVH2或SlSUVH4基因导入目的植物中，获得的番茄SlSUVH2或SlSUVH4高表达植物能够显著减轻番茄黄曲叶病毒的侵染，抑制番茄黄曲叶病毒造成的病害。
[0011]一种抗番茄黄曲叶病毒的SlSUVH2或SlSUVH4转基因植物的培育方法：通过农杆菌转化的方法，将SlSUVH2或SlSUVH4基因导入目的植物中，获得番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因高表达植物。
[0012]具体包括以下步骤：
[0013](1)番茄叶片取样，Trizol法抽提RNA，使用oligo(dT)18(5'
‑
TTTTTTTTTTTTTTTTTT
‑
3')引物反转录获得cDNA；
[0014](2)使用引物对SlSUVH2
‑
F、SlSUVH2
‑
R或SlSUVH4
‑
F、SlSUVH4
‑
R，如SEQ ID NO:4
‑
7所示，以cDNA为模板进行PCR扩增，克隆得到SlSUVH2或SlSUVH4，
[0015]SlSUVH2
‑
F：GGGGTACCATGGGTTCTCTAGTCCCATTTCAA；
[0016]SlSUVH2
‑
R：CGGGATCCATCACAGATGGCAAGCTTTC；
[0017]SlSUVH4
‑
F：GGGGTACCATGGTGGTTCCGTGCGTTG；
[0018]SlSUVH4
‑
R：CGGGATCCAAACAAGCGTTTACGACAGTC。
[0019](3)将SlSUVH2或SlSUVH4构建到带有GFP荧光标签的载体上，获得SlSUVH2
‑
GFP或SlSUVH4
‑
GFP重组质粒；
[0020](4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有SlSUVH2
‑
GFP或SlSUVH4
‑
GFP重组质粒的农杆菌；
[0021](5)将带有重组质粒的农杆菌侵染番茄叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；
[0022](6)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用Trizol法抽提RNA，反转录获得cDNA。利用引物对q
‑
SlSUVH2
–
F、q
‑
SlSUVH2
‑
R或q
‑
SlSUVH4
–
F、q
‑
SlSUVH4
‑
R，如SEQ ID NO:8
‑
11所示，以cDNA为模板进行RT
‑
qPCR扩增，检测植物中SlSUVH2或SlSUVH4的表达水平；
[0023]q
‑
SlSUVH2
‑
F：CGGGATCCTGCTGATAATTGTTTTTGTGC；
[0024]q
‑
SlSUVH2
‑
R：CCGCTCGAGTCACCATTCATTGTAAAAATTTGGG；
[0025]q
‑
SlSUVH4
‑
F：CGGGATCCTAAGGGTTACACGTGGACAT；
[0026]q
‑
SlSUVH4
‑
R：CCGCTCGAGCCGGTGGATCATCAACTAAA。
[0027]另外，取叶片抽提总蛋白，进行SDS
‑
PAGE凝胶电泳，再使用GFP抗体进行Western blot确定植物表达了带GFP荧光标签的SlSUVH2
‑
GFP或SlSUVH4
‑
GFP；对以上阳性植株留种。
[0028]同现有技术相比，本专利技术的突出效果在于：
[0029]本专利技术发现了番茄中SlSUVH2和SlSUVH4基因是抗病基因，并克隆了该基因，通过农杆菌转化的方法，将SlSUVH2或SlSUVH4基因导入目的植物中，获得了番茄SlSUVH2或SlSUVH4高表达转基因植物，获得的SlSUVH2或SlSUVH4转基因植物能够显著减轻番茄黄曲叶病毒的侵染，抑制番茄黄曲叶病毒造成的病害本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用，其特征在于：所述SlSUVH2和SlSUVH4基因的转录本序列如SEQ ID NO:1
‑
2所示。2.根据权利要求1所述番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述双生病毒为番茄黄曲叶病毒。3.根据权利要求2所述番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：通过农杆菌转化的方法，将SlSUVH2或SlSUVH4基因导入目的植物中，获得的番茄SlSUVH2或SlSUVH4高表达植株能够显著减轻番茄黄曲叶病毒的侵染。4.一种抗番茄黄曲叶病毒的SlSUVH2或SlSUVH4转基因植物的培育方法，其特征在于：通过农杆菌转化的方法，将SlSUVH2或SlSUVH4基因导入目的植物中，获得番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因高表达植物，所述SlSUVH2和SlSUVH4基因的转录本序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。5.根据权利要求4所述的SlSUVH2或SlSUVH4转基因植物培育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)番茄叶片取样，使用Trizol法抽提RNA，使用oligo(dT)
18
引物，反转录获得cDNA；(2)使用引物对SlSUVH2
‑
F、SlSUVH2
‑
R或SlSUVH4
‑
F、SlSUVH4
‑
R，以cDNA为模板进行PCR扩增，克隆得到SlSUVH2或SlSUVH4；(3)将SlSUVH2或SlSUVH4构建到带有GFP荧光标签的载体上，获得SlSUVH2
‑
GFP或SlSUVH4
‑
GFP重组质粒；(4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有SlSUVH2
‑
GFP或SlSUVH4
‑
GFP重组质粒的农杆菌；(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染番茄叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；(6)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用Trizol法抽提RNA，反转录获得cDNA；利用引物对q
‑
SlSUVH2
–
F、q
‑
SlSUVH2
‑
R或q
‑
SlSUVH4
–
F、q
‑
SlSUVH4
‑
R，以cDNA为模板进行RT
‑
qPCR扩增，检测植物中SlSUV...

【专利技术属性】
技术研发人员：李方方，刘贺，张明振，周雪平，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：