用于疗法中的RAG1的替代物制造技术

本发明专利技术涉及分离的多核苷酸，其从5

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于疗法中的RAG1的替代物
专利

[0001]本专利技术涉及用于对细胞进行基因编辑以引入RAG1多肽的方法，例如作为重度联合免疫缺陷的治疗。本专利技术还涉及用于所述方法中的多核苷酸、载体、向导RNA、试剂盒、组合物和基因编辑系统。本专利技术还涉及通过所述方法获得或可获得的基因组和细胞。
[0002]专利技术背景
[0003]RAG1和RAG2蛋白启动V(D)J重组，从而生成多样化的T细胞和B细胞库(Teng G,Schatz DG.Advances in Immunology.2015；128:1
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39)。人的RAG突变导致广谱的表型，包括T
‑
B
‑
SCID、Omenn综合征(OS)、非典型SCID(AS)和联合免疫缺陷伴肉芽肿/自身免疫(CID
‑
G/AI)(Notarangelo LD,et al.Nat Rev Immunol.2016；16(4):234
‑
246)。
[0004]造血干细胞移植(HSCT)是严重形式的RAG1缺陷的支柱，包括T
‑
B
‑
SCID、OS和AS，从匹配同胞以外的供体移植后总体生存为约80％(Haddad E,et al.Blood.2018；132(17):1737
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49)。然而，非匹配同胞供体的总体生存较低，并且在不存在清髓或降低强度调理的情况下观察到高移植失败率和不良T细胞和B细胞免疫重建。除了供体类型和调理外，与HSCT后较差结果相关联的其他因素包括年龄(>3.5个月的生命)和移植时的感染。
[0005]基因疗法代表克服HSCT障碍的替代方法。基因校正的造血干细胞(HSC)克服在不存在RAG活性的情况下发生的T和B细胞阻断的选择性优势代表开发此类策略的基本原理。近年来，慢病毒载体已成为递送感兴趣的转基因并使其在合适的启动子控制下表达的首选策略(Naldini L,Nature.2015；526:351
‑
360)。在RAG1缺陷的情况下，观察到内源性RAG1基因表达在细胞周期和淋巴发育期间受到严格调控，可能暴露出异位或失调基因表达可能导致免疫失调或白血病的风险(Lagresle
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Peyrou C,et al.Blood.2006；107(1):63
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72；Pike
‑
Overzet K,et al.Leukemia.2011；25(9):1471
–
83；和Pike
‑
Overzet K,et al.Journal of Allergy and Clinical Immunology.2014；134:242
‑
243)。若干小组已经在临床前模型中检查慢病毒介导的基因疗法用于RAG缺陷的安全性和功效，该临床前模型显示不良免疫重建或严重的炎症体征，伴皮肤、肺、肝、肾中的细胞浸润，以及循环抗双链DNA的存在(van Til NP,et al.J Allergy Clin Immunol.2014；133(4):1116
–
23)。
[0006]总的来说，这些数据引起对允许基因表达的次优水平和失调模式的常规RAG1基因疗法载体的临床使用的重大关注。
[0007]因此，需要用于RAG1缺陷的改进治疗。

技术实现思路

[0008]本专利技术人已开发通过靶向位于第二外显子5
’
的基因组区(其含有该基因的整个编码序列)来校正RAG1基因中的突变的基因编辑策略。
[0009]本专利技术人已设计并选择出一组CRISPR
‑
Cas9核酸酶，并鉴定出人RAG1基因的第一内含子的非重复区中的特异性位点。本专利技术人已经鉴定出向导RNA和用于递送CRISPR
‑
Cas9核酸酶核糖核蛋白复合物的最佳条件。同时，本专利技术人开发了携带人RAG1 cDNA的供体DNA。
[0010]基因编辑策略允许在缺乏RAG1表达和表达重组盒的替代细胞系以及人从动员外
周血(mPB)中获得的CD34+HSC两者中的高水平的活性(以NHEJ诱变频率衡量)和靶向效率(以GFP表达衡量)。使用基因编辑策略在动员外周血(mPB)CD34
+
细胞中实现高编辑效率。
[0011]一方面，本专利技术提供了多核苷酸，其从5
’
到3
’
包含：第一同源区、剪接接受体序列、编码RAG1多肽的核苷酸序列和第二同源区。
[0012]另一方面，本专利技术提供了多核苷酸，其从5
’
到3
’
包含：第一同源区、编码RAG1多肽的核苷酸序列和第二同源区。
[0013]在一些实施方案中：
[0014](i)第一同源区与RAG1内含子1的第一区同源，并且第二同源区与RAG1内含子1的第二区同源；或者
[0015](ii)第一同源区与RAG1内含子1或RAG1外显子2的第一区同源，并且第二同源区与RAG1外显子2的第二区同源。
[0016]在一些实施方案中，第一同源区与RAG1内含子1的第一区同源，并且第二同源区与RAG1内含子1的第二区同源。
[0017]在一些实施方案中，第一同源区与RAG1内含子1的第一区同源，并且第二同源区与RAG1外显子2的第二区同源。
[0018]在一些实施方案中，第一同源区与RAG1外显子2的第一区同源，并且第二同源区与RAG1外显子2的第二区同源。
[0019]在一些实施方案中：
[0020](i)第一同源区与chr 11:36569295上游的区同源，并且第二同源区与chr11:36569298下游的区同源；
[0021](ii)第一同源区与chr 11:36573790上游的区同源，并且第二同源区与chr11:36573793下游的区同源；
[0022](iii)第一同源区与chr 11:36573641上游的区同源，并且第二同源区与chr11:36573644下游的区同源；
[0023](iv)第一同源区与chr 11:36573351上游的区同源，并且第二同源区与chr11:36573354下游的区同源；
[0024](v)第一同源区与chr 11:36569080上游的区同源，并且第二同源区与chr11:36569083下游的区同源；
[0025](vi)第一同源区与chr 11:36572472上游的区同源，并且第二同源区与chr11:36572475下游的区同源；
[0026](vii)第一同源区与chr 11:36571458上游的区同源，并且第二同源区与chr11:36571461下游的区同源；
[0027](viii)第一同源区与chr 11:36571366上游的区同源，并且第二同源区与chr 11:36571369下游的区同源；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.分离的多核苷酸，其从5
’
到3
’
包含：第一同源区、剪接接受体序列、编码RAG1多肽的核苷酸序列和第二同源区。2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中：(i)所述第一同源区与RAG1内含子1的第一区同源，并且所述第二同源区与RAG1内含子1的第二区同源；或者(ii)所述第一同源区与RAG1内含子1或RAG1外显子2的第一区同源，并且所述第二同源区与RAG1外显子2的第二区同源。3.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中所述第一同源区与RAG1内含子1的第一区同源并且所述第二同源区与RAG1内含子1的第二区同源。4.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中：(i)所述第一同源区与chr 11:36569295上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36569298下游的区同源；(ii)所述第一同源区与chr 11:36573790上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36573793下游的区同源；(iii)所述第一同源区与chr 11:36573641上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36573644下游的区同源；(iv)所述第一同源区与chr 11:36573351上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36573354下游的区同源；(v)所述第一同源区与chr 11:36569080上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36569083下游的区同源；(vi)所述第一同源区与chr 11:36572472上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36572475下游的区同源；(vii)所述第一同源区与chr 11:36571458上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36571461下游的区同源；(viii)所述第一同源区与chr 11:36571366上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36571369下游的区同源；(ix)所述第一同源区与chr 11:36572859上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36572862下游的区同源；(x)所述第一同源区与chr 11:36571457上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36571460下游的区同源；(xi)所述第一同源区与chr 11:36569351上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36569354下游的区同源；或者(xii)所述第一同源区与chr 11:36572375上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36572378下游的区同源。5.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中：(i)所述第一同源区与chr 11:36569295上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36569298下游的区同源；(ii)所述第一同源区与chr 11:36573351上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36573354下游的区同源；或者
(iii)所述第一同源区与chr 11:36571366上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36571369下游的区同源；优选地，其中所述第一同源区与chr 11:36569295上游的区同源，并且所述第二同源区与chr 11:36569298下游的区同源。6.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述第一同源区与包含chr 11:36569245
‑
chr 11:36569294的区同源和/或所述第二同源区与包含chr 11:36569299
‑
chr 11:36569348的区同源。7.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述第一同源区的3
’
末端序列包含与SEQ ID NO:7具有至少70％同一性的核苷酸序列或由其组成，和/或所述第二同源区的5
’
末端序列包含与SEQ ID NO:19具有至少70％同一性的核苷酸序列或由其组成。8.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述第一同源区包含与SEQ ID NO:31或其片段具有至少70％同一性的核苷酸序列或由其组成，和/或所述第二同源区包含与SEQ ID NO:32或其片段具有至少70％同一性的核苷酸序列或由其组成。9.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述第一和第二同源区的长度各自为50
‑
1000bp、长度各自为100
‑
500bp或长度各自为200
‑
400bp。10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码RAG1多肽的核苷酸序列包含编码与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5具有至少70％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列或由其组成。11.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码RAG1多肽的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:6具有至少70％同一性的核苷酸序列或由其组成。12.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述剪接接受体位点包含与SEQ ID NO:33具有至少70％同一性的核苷酸序列或由其组成。13.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码RAG1多肽的核苷酸序列可操作地连接至聚腺苷酸化序列，任选地其中所述聚腺苷酸化序列是bGH聚腺苷酸化序列。14.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码RAG1多肽的核苷酸序列可操作地连接至聚腺苷酸化序列，所述聚腺苷酸化序列包含与SEQ ID NO:35具有至少70％同一性的核苷酸序列或由其组成。15.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码RAG1多肽的核苷酸序列可操作地连接Kozak序列，任选地其中所述Kozak序列包含与SEQ ID NO:36具有至少70％同一性的核苷酸序列或由其组成。16.根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:39具有至少70％同一性的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：特莱索恩基金会，
类型：发明
国别省市：