一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术技术领域，具体涉及一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘及其制备方法和应用。本发明专利技术所述含定点标记位点的跨膜区的制备方法通过在跨膜蛋白的跨膜区(TMD)中引入半胱氨酸突变后与标记化合物进行偶联，实现跨膜蛋白跨膜区的定点标记，得到含定点标记位点的跨膜区。进一步的，本发明专利技术通过将所述含定点标记位点的跨膜区和胞外域(ECD)分别进行表达，并将TMD和ECD连接后置于最接近生理环境的纳米盘中，得到含定点标记的跨膜蛋白纳米盘，与传统直接将整个抗原一起表达，并利用去污剂进行纯化的跨膜蛋白制备方法相比，本发明专利技术所述制备方法在实现对跨膜蛋白定点标记的同时，还可以提高跨膜蛋白的表达量且保持跨膜蛋白活性。以提高跨膜蛋白的表达量且保持跨膜蛋白活性。以提高跨膜蛋白的表达量且保持跨膜蛋白活性。

【技术实现步骤摘要】
一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物技术
，具体涉及一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]跨膜蛋白是指一种贯穿生物膜两端的蛋白。细胞可通过跨膜蛋白感知周围环境，以对细胞外环境做出应答反应，实现信号转导，从而调控细胞的状态。跨膜蛋白参与到了包括细胞增殖、细胞分化、细胞生存、凋亡、血管生成和肿瘤等多种重要的生理及病理进程中。许多疾病都与跨膜蛋白的功能异常有关，如胰岛素受体功能异常导致的糖尿病，人表皮生长因子受体
‑
2(HER2受体)异常导致肿瘤的发生等。
[0003]跨膜蛋白的功能使其成为许多药物作用的靶点，如目前约30％的药物靶点都为G蛋白偶联受体(GProtein
‑
CoupledReceptors，GPCR)。由于跨膜蛋白是一种跨越整个生物膜一次或多次的蛋白，其跨膜区具有较强的疏水性，因此跨膜蛋白在水中会聚集并形成沉淀。因此，在体外跨膜蛋白需要维持脂双层膜或类脂环境才可以保持其活性。
[0004]目前对于跨膜蛋白的体外制备，通常是直接将整个抗原一起表达，并利用去污剂进行纯化，存在表达量低、提取困难、均一性差、难以定点标记的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘及其制备方法和应用，所述制备方法可以实现对跨膜蛋白的定点标记，提高跨膜蛋白的表达量。
[0006]本专利技术提供了一种含定点标记位点的跨膜区的制备方法，包括如下步骤：
[0007]在编码跨膜蛋白的跨膜区的基因片段中引入半胱氨酸突变，得到含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段；
[0008]将所述含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段进行表达，得到含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段；
[0009]将标记化合物与所述含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段上的半胱氨酸突变位点偶联，得到含定点标记位点的跨膜区。
[0010]优选的，所述跨膜蛋白包括含胞外域和跨膜区的跨膜蛋白。
[0011]本专利技术还提供了一种含定点标记位点的跨膜区，采用上述技术方案所述的制备方法制备得到。
[0012]本专利技术还提供了一种含定点标记位点的跨膜区纳米盘，所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘包括上述技术方案所述的含定点标记位点的跨膜区和纳米盘；所述纳米盘包裹或插入所述含定点标记位点的跨膜区。
[0013]优选的，所述纳米盘包括磷脂纳米盘。
[0014]本专利技术还提供了一种定点标记的跨膜蛋白纳米盘，包括上述技术方案所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘和胞外域。
[0015]本专利技术还提供了上述技术方案所述的定点标记跨膜蛋白纳米盘的制备方法，将所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘的氨基端与胞外域的羧基端进行连接，得到所述可定点标记的跨膜蛋白纳米盘。
[0016]优选的，所述连接的方式包括酶连反应或肽链连接。
[0017]优选的，所述酶连反应使用的酶包括Sortase酶或Butelase酶。
[0018]本专利技术还提供了上述技术方案所述的含定点标记位点的跨膜区、含定点标记位点的跨膜区纳米盘、定点标记的跨膜蛋白纳米盘或所述的制备方法制备得到定点标记的跨膜蛋白纳米盘在抗体的筛选和/或验证中的应用。
[0019]有益效果：
[0020]本专利技术提供了一种含定点标记位点的跨膜区的制备方法，所述制备方法通过在跨膜蛋白的跨膜区(TMD)中引入半胱氨酸突变后与标记化合物进行偶联实现跨膜蛋白跨膜区的定点标记，得到含定点标记位点的跨膜区。
[0021]进一步的，本专利技术通过将所述含定点标记位点的跨膜区和胞外域(ECD)，分别进行表达，并将TMD和ECD连接后置于最接近生理环境的纳米盘中，得到含定点标记的跨膜蛋白纳米盘，与传统直接将整个抗原一起表达，并利用去污剂进行纯化的跨膜蛋白制备方法相比，本专利技术所述制备方法在实现对跨膜蛋白定点标记的同时，还可以提高跨膜蛋白的表达量且保持跨膜蛋白活性。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0023]图1为实施例1中hCD137 TMD的制备液相色谱纯化峰图；
[0024]图2为实施例1中引入半胱氨酸的hCD137 TMD的SDS
‑
PAGE胶和质谱检测结果图；
[0025]图3为实施例2中Proxyl
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TMD的制备液相色谱纯化峰图；
[0026]图4为实施例2中Proxyl
‑
TMD的质谱检测结果图；
[0027]图5为实施例3中MSP蛋白的SDS
‑
PAGE胶检测结果；
[0028]图6为实施例3中含定点标记的Proxyl
‑
TMD纳米盘的SDS
‑
PAGE胶检测结果；
[0029]图7为实施例4中hCD137 ECD的SDS
‑
PAGE胶检测结果；
[0030]图8为实施例5中sortase A酶的SDS
‑
PAGE胶检测结果；
[0031]图9为实施例5中含hCD137 ECD
‑
TM的纳米盘的SDS
‑
PAGE胶检测结果；
[0032]图10为实施例5中用含三氟甲基的化合物标记的hCD137 ECD
‑
TM的纳米盘的
19
F
‑
NMR结果；
[0033]图11为应用例1中anti
‑
hCD137纳米抗体的SDS
‑
PAGE胶检测结果；
[0034]图12应用例1中与纳米抗体结合后的含hCD137跨膜抗原纳米盘的FPLC和SDS
‑
PAGE胶检测结果图；
[0035]图13为实施例6中Proxyl
‑
hHER2 TMD的峰图；
[0036]图14为实施例6中Proxyl
‑
hHER2 TMD纳米盘的SDS
‑
PAGE胶检测结果；
[0037]图15为实施例6中hHER2 ECD的SDS
‑
PAGE胶检测结果；
[0038]图16为实施例6中hHER2 ECD
‑
TM纳米盘的SDS
‑
PAGE胶检测结果；
[0039]图17为应用例2中anti
‑
hHER2纳米抗体的SDS
‑
PAGE胶检测结果；
[0040]图18为应用例2中与纳米抗体结合后的含hHER2跨膜抗原纳米盘的FPLC和SDS
‑
PAGE胶检测结果图。
具体实施方式
[0041]本专利技术提供了一种含定点标记位点的跨膜区的制备方法，包括如下步骤：
[0042]在编码跨膜蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含定点标记位点的跨膜区的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在编码跨膜蛋白的跨膜区的基因片段中引入半胱氨酸突变，得到含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段；将所述含有半胱氨酸突变的跨膜区的基因片段进行表达，得到含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段；将标记化合物与所述含有半胱氨酸突变位点的跨膜区肽段上的半胱氨酸突变位点偶联，得到含定点标记位点的跨膜区。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述跨膜蛋白包括含胞外域和跨膜区的跨膜蛋白。3.一种含定点标记位点的跨膜区，其特征在于，采用权利要求1或2所述的制备方法制备得到。4.一种含定点标记位点的跨膜区纳米盘，其特征在于，所述含定点标记位点的跨膜区纳米盘包括权利要求3所述的含定点标记位点的跨膜区和纳米盘；所述纳米盘包裹或插入所述含定点标记位点的跨膜区。5.根据权利要求4所述的含定点标记位点的跨膜区纳米...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹婵，龚军源，周小晖，蔺一凡，耿嘉璐，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：