一种cysB突变体、高产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及代谢工程技术领域，尤其涉及一种cysB突变体、高产L

【技术实现步骤摘要】
一种cysB突变体、高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及代谢工程
，尤其涉及一种cysB突变体、高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]在大肠杆菌中，L
‑
半胱氨酸的合成分为碳模块和硫模块。其中碳模块中的cysE为限制因素之一，在cysE编码的L
‑
丝氨酸
‑
O乙酰基转移酶的催化下，乙酰辅酶A和L
‑
ser发生乙酰化反应生产碳骨架OAS，然后硫化物结合到OAS中再逐步形成产物L
‑
半胱氨酸。大肠杆菌中存在两种无机硫的代谢途径，其一是硫代硫酸盐途径，硫代硫酸盐进入细胞后，CysM催化S2O
32
‑
于OAS结合形成SSC，SSC被NrdH和Grx1还原为L
‑
半胱氨酸和亚硫酸盐(SO
32
‑
)；其二是硫酸盐通话途径，硫酸盐转运进细胞后经过cysIJ、cysK等基因的作用最后在cysK编码的OAS巯基酶
‑
A的催化下OAS接受S2‑
生成L
‑
半胱氨酸。其中在硫酸盐途径中硫酸盐转运蛋白、还原硫酸盐以及合成半胱氨酸的酶的表达均由转录调控因子CysB控制，其CysB蛋白作为硫酸盐代谢和半胱氨酸生物合成的分子传感器，不断监测代谢中间物的细胞内水平。转录调控因子CysB能够正向调控cysK、cysM等基因，且能够阻遏自身的启动子区域及hslJ基因。于2000年发表的Functional Dissection of the LysR
‑
type CysB Transcriptional Regulator文献中构建了cysB的高通量筛选系统，并发现Y164N和A227D两个突变体有解除OAS激活的作用；以及在1996年文献中In vitro characterization of constitutive CysB proteins from Salmonella typhimurium中T149M及T149P两种突变体对抗诱导剂不敏感，以此为借鉴进行后续研究。
[0003]CysB调控蛋白通常以二聚体或四聚体形式行使功能。CysB具有两个不同的变构配体结合口袋：1.硫酸盐和NAS特异性位点；2.NAS和OAS特异性结合位点，OAS通过二号口袋结合来重塑一号口袋，同时使用DNA结合和定点诱变的方法，发现OAS增强了NAS介导的激活，而位点1的突变对位点2介导的OAS激活没有影响。cysB与cysJIH、cysK和cysP启动子的
‑
35区域上游特定位点结合，在NAS的存在下刺激转录。CysB通过与相邻位点结合而弯曲这些启动子，NAS可以降低这种弯曲幅度。同时，在对鼠伤寒门沙氏菌的cysB实验中发现CysB与CysJIH单独结合不足以引起转录起始复合物的形成，需要添加NAS或OAS才能发生转录。
[0004]在大肠杆菌微生物发酵生产L
‑
半胱氨酸的过程中，对于硫源的利用率始终没有提高，故希望通过CysB的结构变化在一定程度上增强与硫化物的同化。同时由于CysB受OAS的激活作用，说明在OAS不足的情况下碳途径对于硫途径存在一定抑制作用，因此解除这种激活，使受到CysB调控的硫代谢途径的相关基因能够稳定表达对于L
‑
半胱氨酸的生产十分重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种cysB突变体、高产L
‑
半
胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，并将其应用于发酵生产L
‑
半胱氨酸，以克服现有技术中存在的L
‑
半胱氨酸生产菌株在发酵生产L
‑
半胱氨酸过程中对硫源结合能力不足及受OAS激活作用，导致产量较低的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术的第一个目的在于，提供一种cysB突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术的第二个目的在于，提供所述的cysB突变体在构建高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌中的应用。
[0008]CysB作为转录调控因子，在自然情况下以四聚体形式存在与DNA启动子区域结合，且结合后行使激活/抑制作用，目前硫同化途径中cysK、cysPUWA、cysM、cysJIH等均为CysB正向激活基因，因此若得到一个不受OAS激活作用且能稳定表达的CysB，或许能够使受CysB调控的硫同化途径的相关基因稳定地高强度表达，从而增强硫利用率，同时也能够进一步提升L
‑
半胱氨酸的产量。故本专利技术通过对CysB硫酸盐口袋突变获得稳定表达水平且不受OAS激活作用的cysB
V122G
。
[0009]本专利技术的第三个目的在于，提供一种高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：(1)对调节转录因子cysB的硫酸盐结合口袋进行突变，筛选获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的突变体cysB
V122G
；(2)构建重组质粒pTrc99a
‑
cysB
V122G
‑
p
cysK
‑
eGFP；(3)以菌株E.coli W3110 EYC::P
yhaO
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ydeD::P
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yfiK::P
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‑
yeaS::P
yhaO
‑
alaE::P
yhaO
‑
apFAB689
‑
tolC/pE为底盘菌，敲除基因组上的cysB，消除质粒PE，并导入步骤(2)中所构建的重组质粒pTrc99a
‑
cysB
V122G
‑
p
cysK
‑
eGFP，得到E.coli W3110 EYC::P
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‑
ydeD::P
yhaO
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yea S::P
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‑
alaE::P
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‑
tolC
‑
ΔcysB/pTrc99a
‑
cysB
V122G
‑
p
cysK
‑
eGFP，即为所述高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌。
[0010]作为优选，所述重组质粒pTrc99a
‑
cysB
V122G
‑
p
cysK
‑
eGF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种cysB突变体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的cysB突变体在构建高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌中的应用。3.一种高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，由如下方法构建获得：(1)对调节转录因子cysB的硫酸盐结合口袋进行突变，筛选获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的突变体cysB
V122G
；(2)构建重组质粒pTrc99a
‑
cysB
V122G
‑
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cysK
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eGFP；(3)以菌株E.coli W3110 EYC::P
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tolC/pE为底盘菌，敲除基因组上的cysB，消除质粒PE，并导入步骤(2)中所构建的重组质粒pTrc99a
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cysB
V122G
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cysK
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eGFP，得到E.coli W3110 EYC::P
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tolC
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ΔcysB/pTrc99a
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cysB
V122G
‑
p
cysK
‑
eGFP，即为所述高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌。4.如权利要求3所述的一种高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述重组质粒pTrc99a
‑
cysB
V122G
‑
p
cysK
‑
eGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。5.一种用于构建权利要求3或4所述的高产L
‑
半胱氨酸的基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)运用基因编辑技术，对调节转录因子CysB的硫酸盐结合口袋进行随机突变，根据荧光强度筛选得到突变体cysB
V122G
；(2)以质粒pTrc99a为模板，通过引物扩增得到cysK的启动子核苷酸片段以及eGFP核苷酸片段，将cysK的启动子核苷酸片段以及eGFP核苷酸片段分别整合至pTrc99a质粒多克隆位点上，得到重组质粒pTrc99a
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博，修晓玲，潘佳园，陈立峰，柳志强，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：