一种大麻二酚酸合成酶的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种大麻二酚酸合成酶的应用，涉及合成生物学技术领域。具体地，本发明专利技术提供一种大麻二酚酸合成酶在提高由大麻萜酚酸生成大麻二酚酸的转化效率中的应用，所述大麻二酚酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提取高大麻二酚含量大麻叶片的基因组，通过PCR扩增获得了CBDAS基因，将该基因在毕赤酵母中异源表达，得到了高催化活性的大麻二酚酸合成酶，该大麻二酚酸合成酶可以提高底物大麻萜酚酸转化为大麻二酚酸的转化率，避免在利用大麻植株提取大麻二酚时，植株中残存大麻萜酚酸未被转化成大麻二酚而造成的浪费，可进一步提高大麻二酚的产量。进一步提高大麻二酚的产量。进一步提高大麻二酚的产量。

【技术实现步骤摘要】
一种大麻二酚酸合成酶的应用


[0001]本专利技术涉及合成生物学
，特别是涉及一种大麻二酚酸合成酶的应用。

技术介绍

[0002]大麻(Cannabis sativa L.)是一年生麻科草本植物，被称为大麻或汉麻，在世界各地种植已有数千年，目前为止，已分离出100多种大麻素。其中，酸性大麻素四氢大麻酚酸(THCA)、大麻二酚酸(CBDA)和大麻色酸(CBCA)含量最丰富，其他类型大麻素大多是由这三种物质在热和光照下通过非酶转化、降解反应和自氧化等方式获得。大麻二酚(CBD)是一种与THC具有不同环状结构的同分异构体，近年来在治疗阿尔兹海默病、帕金森病、癫痫，以及抗肿瘤和神经保护等方面发挥着重要作用。但由于CBD原料短缺、价格高昂、生物提取得率低等问题，限制了其在医疗领域的广泛使用。
[0003]毕赤酵母(Pichiapastoris)是在甲醇培养基中生长的一种甲基营养菌，可利用AOX1启动子来驱动外源蛋白的高水平表达。酵母异源表达系统有许多优点，发酵培养基取材稳定、成本低廉、繁殖快速；与细菌相比，具有翻译后修饰，易于遗传操作等优势。外源目的基因线性化后，利用同源重组方式可将外源基因高效整合到酵母细胞的染色体中，产生稳定的细胞系。
[0004]大麻二酚酸合成酶(CBDAS)可催化底物大麻萜酚酸(CBGA)生成CBDA，而CBDA在高温下易脱羧形成CBD。若能通过操作简便，经济高效的方法获得CBDAS，就可在利用大麻植株提取CBD的过程中，通过进一步催化CBGA继续合成CBDA，利用二次体外反应来增加CBD的产量。因此，有必要开发一种高产大麻二酚酸合成酶的毕赤酵母菌株，为CBDAS的工业化生产奠定基础。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种大麻二酚酸合成酶的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术提供的大麻二酚酸合成酶可以提高底物CBGA转化为CBDA的转化率，避免在利用大麻植株提取CBD时，植株中残存CBGA未被转化成CBD而造成的浪费，从而进一步提高CBD的产量。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种大麻二酚酸合成酶在提高由大麻萜酚酸生成大麻二酚酸的转化效率中的应用，其特征在于，所述大麻二酚酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]进一步地，所述大麻二酚酸合成酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示。
[0009]进一步地，所述大麻二酚酸合成酶由一种重组微生物菌株表达，所述重组微生物菌株包括如SEQ ID NO.1所示的基因。
[0010]进一步地，所述重组微生物菌株为重组毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株。
[0011]进一步地，所述重组微生物菌株的构建方法，包括以下步骤：
[0012](1)将如SEQ ID NO.1所示的编码基因连接入表达载体，得到重组质粒；
[0013](2)将所述重组质粒导入毕赤酵母感受态细胞，筛选得到阳性重组子，即为所述重组微生物菌株。
[0014]进一步地，在步骤(1)中，所述表达载体为pPIC9K载体。
[0015]本专利技术还提供一种提高从大麻植株中提取大麻二酚的产量的方法，包括利用氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大麻二酚酸合成酶催化大麻植株中的大麻萜酚酸生成大麻二酚酸，进而形成大麻二酚的步骤。
[0016]本专利技术公开了以下技术效果：
[0017](1)本专利技术以高CBD含量的大麻叶片为材料，采用PCR克隆技术获得CBDAS基因，并构建酵母表达载体，在毕赤酵母中重组表达。经生物活性分析后表明，该毕赤酵母菌株可以高效表达CBDAS，而且在将底物CBGA转化为CBDA时具有较高活性。利用该毕赤酵母菌株高效表达的CBDAS催化反应12h后，以大麻叶片粗提液中CBGA为底物时再次合成CBDA 60.64ng/mL，CBD 128.01ng/mL；而以CBGA标准品为底物时合成CBDA 20.12ng/mL，CBD 207.87ng/mL。
[0018](2)利用本专利技术提供的大麻二酚酸合成酶，可以在利用大麻植株提取CBD时，将植株中残存的CBGA进行体外反应，进一步生物合成CBDA，进而脱羧形成CBD，避免大麻植株中残存CBGA未被转化成CBD而造成浪费，从而进一步提高CBD的产量。
[0019](3)本专利技术构建的毕赤酵母菌株生长周期短，培养成本低廉，重组酶表达稳定，具有翻译后修饰等特点，可进行批量工厂化生产。
[0020](4)本专利技术还为大麻中其他有益大麻素的获得提供了参考方案。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1为CBDAS基因扩增结果；其中M：DS2000 Marker；1：CBDAS扩增片段；
[0023]图2为pPIC9K
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CBDAS重组载体图谱；
[0024]图3为重组毕赤酵母PCR鉴定结果；其中，M：DS5000 Marker；1：阴性对照；2：pPIC9K
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CBDAS质粒；3
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5：重组毕赤酵母的PCR产物；
[0025]图4为重组酶催化底物CBGA产生CBDA和CBD的情况；其中A图为pPIC9K
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CBDAS粗酶液催化大麻叶片粗提液中CBGA在不同时间生成CBDA和CBD的情况；B图为pPIC9K
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CBDAS粗酶液催化CBGA标准品在12h生成CBDA和CBD的情况；在A中，CK为只加底物不加酶液的空白对照(即对比例1)，pPIC9K为空载转入酵母菌提取粗酶液(即对比例2)，pPIC9K
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CBDAS表示实施例2；在B中，CK为只加底物不加酶液的空白对照(即对比例3)，pPIC9K为空载转入酵母菌提取粗酶液(即对比例4)，pPIC9K
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CBDAS表示实施例3；不同小写字母表示不同样品间差异显著(P＜0.05)。
具体实施方式
[0026]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0027]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0028]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大麻二酚酸合成酶在提高由大麻萜酚酸生成大麻二酚酸的转化效率中的应用，其特征在于，所述大麻二酚酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大麻二酚酸合成酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述大麻二酚酸合成酶由一种重组微生物菌株表达，所述重组微生物菌株包括如SEQ ID NO.1所示的基因。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组微生物菌株为重组毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴凌燕，牛庭莉，李志江，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：