本发明专利技术是一种同时转两张膜，标记两种蛋白ＴＲＸ和ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ１２的方法，包括细胞总蛋白的提取、蛋白定量、凝胶电泳、蛋白印迹、抗体的同时标记以及Ｘ光片显影等步骤。旨在通过建立一种细胞中的总蛋白在经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白印迹后，将两张ＰＶＤＦ膜用于对两种目的蛋白，使用不同抗体同时标记同时检测的方法，同时还将该方法与传统的剥膜再标记抗体的方法相比较，对这种方法的准确性，重复性和稳定性等方面进行评价。本发明专利技术简单易行，并且实验结果能够得到很好的重现，为多种蛋白检测提供了一种更为简单易行，既节约时间和又节约样品方法，具有实际应用价值。
【技术实现步骤摘要】
,同时标记蛋白TRX和procaspase12的方法
本专利技术属于分子生物学领域，涉及，标记蛋白TRX和 procaspase12的方法，从而检测两种目的蛋白的变化情况。
技术介绍
蛋白免疫印迹(Western Blot)是根据抗原抗体的特异性结合检测复 杂样品中的某种蛋白的方法。western blot是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的'一 种新的免疫生化技术，主要包括凝胶电泳，蛋白印迹(转膜)和免疫学检 测三部分。凝胶电泳是将待测样品中的蛋白质根据分子量大小在凝胶中分成条 带。蛋白印迹是指将凝胶电泳分离的蛋白质样品转移到固相载体(例如硝 酸纤维素薄膜或PVDF膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能 保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或 多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标二抗起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异'li目的基因表达的蛋白成分。目前，凝胶电泳技术已应用于检测蛋白水平的表达。但现有技术中未见 有，标记蛋白TRX和procaspase12的方法的报道。
技术实现思路
本专利技术旨在通过建立一种细胞中的总蛋白在经过SDS-PAGE和蛋白印 迹后，将两张PVDF膜上的两种目的蛋白用不同抗体同时标记同时检测的方 法。并将该方法与传统的剥膜再标记抗体的方法相比较，对这种方法的准 确性，重复性和稳定性等方面进行评价，为多种蛋白检测提供了一种简单 易行的方法，即节约时间又节约样品，有应用价值。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案一次转两张膜，同时标记蛋白TRX和procaspase12的方法，包括细胞总 蛋白的提取、蛋白定量、凝胶电泳、蛋白印迹、抗体的同时标记以及X光片显影步骤。具体地，提取细胞总蛋白，经蛋白定量后进行凝胶电泳；蛋白经凝胶 电泳后，将两张同样大小的PVDF膜重叠放在胶上，做好标记以便区分，转 膜条件为U=100V, I=350mA， T=70min;将两张膜分别标记TRX和 procaspase12的抗体，进行免疫学检测，X光片显影检测结果。其中，两种抗体的稀释比例分别为TRX 1:5000， procaspase12 1:800。 更具体地，提取PC12细胞总蛋白，利用BCA法对细胞总蛋白定量；将 细胞中提取的总蛋白进行凝胶电泳；用湿转法将胶上的蛋白转移至PVDF膜 上； 一抗标记，抗原抗体孵育70min后用TPBS洗膜；二抗标记，用辣根过 氧化物酶二抗与抗原抗体复合物孵育70min后用TPBS洗膜；加入化学发光 底物显影，得到两种目的蛋白的条带；通过传统的剥膜方法检验本方法的 重复性和稳定性。本专利技术的蛋白免疫印迹中标记两种抗体方法的建立，内容 包括以下几个步骤A. 本专利技术以PC12细胞为例，提取PC12细胞总蛋白，利用BCA法对细胞总蛋白定量。B. 将细胞中提取的总蛋白进行凝胶电泳。C. 用湿转法将胶上的蛋白转移至两张PVDF膜上。D. —抗标记，抗原抗体孵育70min后用TPBS洗膜。E. 二抗标记，用辣根过氧化物酶二抗与抗原抗体复合物孵育70min后 用TPBS洗膜。F. 加入化学发光底物显影，两张膜上可得到两种目的蛋白的条带。G. 检测与传统的剥膜方法相比，该技术的重复性和稳定性。 附图说明图1为一i央胶检测TRX和procaspase12的目的条带； 图2为用传统的剥膜，标记抗体得到的TRX和再procaspase 12的显影结果。 具体实M式下面结合实施例，进一步阐述本专利技术，但不以此来限定本专利技术。 实施例1:一土央胶转两张PVDF膜，同时标记两种抗体-(1) 提取细胞总蛋白药物刺激PC12细胞24h后弃掉培养基，加入2ml 左右PBS冲洗细胞表面残留的培养基，弃掉洗液。加入0. 25%胰酶消化5min 左右终止消化，1500rpm离心5min，弃掉上清，加入lmlPBS悬浮细胞， 1500rpm4。C离心5min，弃掉上清，加入100 u 1细胞裂解液，冰上裂解lh 左右，15000rpm4。C离心15分钟，将上清(细胞总蛋白)转移至新的dorf 管中，-S(TC保存。(2) 蛋白质定量按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。(3) 电泳将提取出来的细胞总蛋白经95。C热变性后进行变性聚丙烯 酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)。 15%分离胶10ml:无菌水2. 3ml， 30%聚 丙烯酰胺5.0ml， Tris(PH=8. 8， 1. 5M) 2.5ml， 10%SDS0. lml， 10%APS 0. 1 ml， TEMED4ul。压縮胶4ml:无菌水2. 7ml， 30%聚丙烯酰胺0. 67ml， Tris(PH=6.8， l.OM) 0.5ml， 10%SDS 40ul，10%APS 40ul， TEMED 4ul。将 准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，电泳分离蛋白。电泳条件 U=180V， I=100mA， T=40min。电泳完成后进行转膜。(4) 转膜由于经过电泳的胶上的蛋白全部带上了负电荷，并且是恒流 转膜，因此转至膜上的蛋白是均匀的，而且转至第一张膜上和第二张膜上 的蛋白与总蛋白的比例都是一样的，故按照负极-棉-三层滤纸-胶-两张 PVDF膜-三层滤纸-棉-正极的顺序进行转膜，转膜条件U二100V， I二350mA， T=70min。冰水中进行。5(5) 封闭将转好的两张PVDF膜用5%脱脂奶封闭过夜，为第二天的抗原抗体标记做准备。(6) —抗标记将封闭过夜的两张PVDF膜从5。/。脱脂奶中取出，用TPBS 清洗三次5min，标记一抗，两张PVDF膜分别标记不同的一抗，本专利技术以 TRX和procaspase12为例，TRX 1: 5000稀释，procaspase12 1: 800稀 释。 一抗标记70min。(7) 二抗标记 一抗标记完成之后，用TPBS洗三次5min，开始二抗标 记。本专利技术的TRX和procaspase12的二抗均为羊抗兔，稀释倍数为1:5000。 二抗标记70min。(8) X光片显影二抗标记完成之后，用TPBS洗三次10min，三次5min， 加入millipore化学发光底物(lml/10cm2)，在暗室中进行显影。实施例2:检测实施例的方法的准确性和稳定性利用传统的剥膜方法进行两种不同抗体的标记，从而检测本专利技术的准确性。具体方法如下(1) 将已经在X光片上显影的标记了 TRX抗体的PVDF膜加入10ml剥 膜液(e-巯基乙醇0.27ml， 10%SDS 2ml， 1.0M Tris 6.8 625ul) ， 60 。C孵育30min，用TBPS清洗三次10min，然后放入5%脱脂奶4t:封闭过夜。(2) 将膜从脱脂奶中取出，用TPBS清洗三次10min，标记procaspase12 一抗，孵育70min。(3) —抗标记完之后，用TPBS清洗三次5min，标记二抗，孵育70min。(4) 二抗标记完成之后，用TPBS清洗三次10min，三次5min，加入化 学发光底物，X光片显影。实施例1和实施例2的结果相同，实验结果得到了很好的重现性。权利要求1、一种同时转2张膜，同时标记蛋白TRX和procaspa本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时转２张膜，同时标记蛋白ＴＲＸ和ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ１２的方法，其特征在于：两张膜分别标记蛋白ＴＲＸ和ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ１２，包括细胞总蛋白的提取、蛋白定量、凝胶电泳、蛋白印迹、抗体的标记以及Ｘ光片显影步骤。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：白洁，冯月梅，李奎，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]
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