一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒、方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒、方法及其应用。所述试剂盒包括细胞固定和打孔液、重悬缓冲液I、重悬缓冲液II、反转录试剂及Tn5转座试剂；本发明专利技术能够实现在保持细胞形态完整的情况下对细胞内mRNA进行原位反转录和基于Tn5酶的转座反应，进而通过简单的PCR扩增和片段筛选得到可用于转录组测序的细胞内全长转录组文库，避免了样本RNA提取过程中的损失，可用于极低样本量的转录组文库构建，并可以结合基于微流控或多孔板技术等的单细胞分选平台，进而构建单细胞全长转录组文库。胞全长转录组文库。胞全长转录组文库。

【技术实现步骤摘要】
一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒、方法及其应用


[0001]本专利技术涉及转录组测序
，更具体地，涉及一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒、方法及其应用。

技术介绍

[0002]转录组指在某一环境下细胞内所有基因转录产物的集合，它是连接生物体遗传元件(基因)和表型(蛋白质)之间的桥梁，因此对于转录组的测定有助于我们理解细胞在响应特定的环境下的基因表达情况。传统上对于基因表达的测定采用RT
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qPCR方法，通过设计针对特定基因cDNA的引物，采用PCR扩增结合荧光基团来检测特定基因的cDNA丰度，进而反映目的基因在样品中的表达情况。但这种方法通量较低，一次只能检测很少的基因，而且对引物的设计要求较高，很难满足大规模鉴定的需要，也难以发现未知的转录本或表达基因。
[0003]随着高通量测序技术的出现，转录组测序(RNA
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seq)技术孕育而生。通过提取组织的RNA后利用与mRNA的polyA互补的polyT作为引物，反转录得到完整的cDNA后再采用限制性内切酶或超声等手段随机打断cDNA，连接上测序接头后进行(或不进行)简单的PCR从而得到能够用高通量测序仪进行测序的文库，之后采用生物信息学手段获得样品中所有基因的表达量等信息。这种方法虽然可以实现大规模的检测样品中基因表达情况，但低效的加测序接头过程以及长时间操作增加了金钱和时间成本。
[0004]后来研究人员发现存在一种Tn5转座酶，这种酶可以与19bp的DNA片段形成复合体，并随机切割双链DNA，切割的同时将自身复合体中的19bp片段连接到切割产物的两端。利用这一特性，研究人员将这19bp与测序接头连接，使其可以在断裂DNA的同时加上测序接头，从而大大的节省了RNA
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seq建库的时间和成本。然而这些方法均需要对样本进行RNA的提取，但在RNA提取的过程中，由于提取效率有限，导致样本中RNA量的损失，从而限制了这些方法在细胞量稀少的珍贵样品中的应用。
[0005]基于此，Picelli,S等于2013年发展出基于孔板的Smart
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seq2技术(Picelli,S.et al.Smart
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seq2 for sensitive full
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length transcriptome profiling in single cells.Nat.Methods 10,1096
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1098,2013)。该技术是将单个细胞分选至96孔或384孔板中，在单个孔中进行细胞裂解，加入含有oligo(dT)的引物反转录合成cDNA第一条链，然后添加特殊的引物经过PCR过程合成cDNA第二条链，再利用改造后的高活性Tn5转座酶对DNA进行打断，同时将接头添加到cDNA的两端进行标记，再进行最后一次PCR扩增后，最终得到单细胞水平的转录组测序文库。这种方法虽然可以达到单细胞水平，而且能够研究mRNA的可变剪接信息，但是通量较低，操作比较耗时耗力，成本相对较高。之后研究人员又开发出基于微流控平台的单细胞测序技术，该技术可以实现高通量的单细胞水平转录组测序，已成为目前单细胞转录组测序的主流方法。但是由于测序仪读长的限制，这种方法要求在mRNA反转成cDNA后进行随机的打断，最终只能富集mRNA 5
’
或3
’
端的几百个碱基序列，因此无法用于mRNA可变剪接的研究，对mRNA的定量也存在一定误差。为此研究人员对测序仪和建库流
程进行了进一步的改进，发展出了第三代高通量测序技术，解决了二代测序仪读长较短的问题。但由于技术的不完善，第三代高通量测序技术成本高昂，碱基错误率较高等特点也让大多数研究人员望而却步。除了测序技术的改进，最近研究人员也发现用于转座的Tn5酶本身也带有RNase H酶的结构域，即也存在可以切割RNA
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DNA杂合链的潜能(Di,L.et al.RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids.Proc.Natl Acad.Sci.USA 117,2886
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2893,2020)。这样的特性就为开发转录组的测序文库构建方法提供了新的思路。
[0006]目前无论是基于孔板的Smart
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seq2技术还是基于微流控的单细胞转录组技术，亦或是第三代高通量测序技术，都需要将细胞裂解后通过带polyT的引物进行反转录cDNA第一链后再以第一链为模板通过PCR合成第二链，最终形成双链cDNA。但RNA提取过程中RNA的损失以及PCR过程中的序列偏好性问题也极大阻碍了对转录组的定量和可变剪接的研究。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座反应的试剂盒。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供所述试剂盒在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座扩增中的应用。
[0009]本专利技术的再一目的在于提供一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的方法。
[0010]本专利技术的再一目的在于提供所述方法在低细胞量或单细胞全长转录组测序文库构建中的应用。
[0011]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0012]一种用于在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒，包括细胞固定和打孔液、重悬缓冲液I、重悬缓冲液II、反转录试剂及Tn5转座试剂；
[0013]所述细胞固定和打孔液为含35～60％甲醇与0.02～0.06％ BSA的PBS溶液；
[0014]所述重悬缓冲液I为含2～4
×
SSC、0.02～0.06％ BSA、0.5～2mM DTT与0.1～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液；
[0015]所述重悬缓冲液II为含0.5～2％ BSA、0.5～2mM DTT与0.1～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液。
[0016]所述BSA为牛血清白蛋白，SSC为柠檬酸钠盐缓冲液，DTT为二硫苏糖醇，PBS为磷酸盐缓冲液。
[0017]所述反转录试剂包括oligo
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dT引物，反转录酶，反转录缓冲液。
[0018]所述Tn5转座试剂包括Tn5转座酶，转座缓冲液及接头序列。
[0019]本专利技术的核心点是在保证细胞完整性(细胞膜结构)的情况下，使反转录和Tn5转座的各种试剂可以顺利进入细胞，对细胞中的RNA进行原位的反转录并通过Tn5酶插入接头序列，实现对细胞内的cDNA进行扩增准备。目前固定剂、破膜剂在现有技术中主要用于流式细胞分析。固定剂起稳定细胞膜、保持细胞膜表面抗体与抗原结合的作用；破膜剂使流动的、完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞。用流式细胞仪检测细胞内抗原及DNA时，对待测细胞进行固定、破膜处理后，加入相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒，其特征在于，包括细胞固定和打孔液、重悬缓冲液I、重悬缓冲液II、反转录试剂及Tn5转座试剂；所述细胞固定和打孔液为含35～60％甲醇与0.02～0.06％BSA的PBS溶液；所述重悬缓冲液I为含2～4
×
SSC、0.02～0.06％BSA、0.5～2mM DTT与0.1～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液；所述重悬缓冲液II为含0.5～2％BSA、0.5～2mM DTT与0.1～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液。2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述细胞固定和打孔液为含38～50％甲醇与0.03～0.05％BSA的PBS溶液；所述重悬缓冲液I为含3～4
×
SSC、0.03～0.05％BSA、0.8～1.5mM DTT与0.2～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液；所述重悬缓冲液II为含0.8～1.5％BSA、0.8～1.5mM DTT与0.2～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液。3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述细胞固定和打孔液为含40％甲醇与0.04％BSA的PBS溶液；所述重悬缓冲液I为含3
×
SSC、0.04％BSA、1mM DTT与0.2U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液；所述重悬缓冲液II为含1％BSA、1mM DTT与0.2U/μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐锦，徐涛，许逸聪，安子扬，李一恒，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：