一种固态发酵制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法技术

本发明专利技术提供了一种固态发酵枯草芽孢杆菌以制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法，其中，采用颗粒直径为２０－４０目、含水量３０％的无霉变玉米芯灭菌后作为固态发酵培养基的固体基质。本发明专利技术的发明专利技术人克服了现有技术持有的“液态发酵枯草芽孢杆菌较固态发酵枯草芽孢杆菌更易从中分离嘌呤核苷磷酸化酶产品”的偏见，使用本发明专利技术的固态发酵方法可以实现从枯草芽孢杆菌中更高效分离嘌呤核苷磷酸化酶产品。本发明专利技术的方法耗能少，耗时少，得到的嘌呤核苷磷酸化酶产品活性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种固态发酵制备酶的方法，更具体地，本专利技术涉及一种固态 发酵制备噪呤核香磷酸化酶的方法。
技术介绍
。票呤核苦磷酸化酶(Purine Nucleoside Phosphorylase， PNP，酶学分类号 为EC 2.4.2.1 )催化如下反应PAT*肌苷(Inosine)十磷酸(Pi)-核糖-1-磷酸(11比036-1卞1103口}^6)+次黄噪呤(Hypoxanthine)其中，肌苷是血清腺苷脱氨酶和5，-核苷酸酶所催化反应的重要产物，因此。票 呤核苷磷酸化酶可用于测定与肝胆疾病相关的血清腺苷脱氨酶和5，-核芬酸酶 活性的临床生化诊断试剂盒。现有的嘌呤核苷磷酸化酶一般通过液体发酵枯草芽孢杆菌获得。例如 CN101289646中公开了通过液体发酵中国微生物菌种保藏管理委员会农业微 生物中心编号为10741的枯草芽孢杆菌(ACCC10741 )获得口票呤核苷磷酸化 酶的方法。其中，为保证该好氧性枯草芽孢杆菌ACCC10741在发酵过程中能 够充分得与氧气接触，需要使用发酵罐、空气压缩机以及空气过滤设备来保证 2.0m々h的通气量。因此现有的液体发酵枯草芽孢杆菌制备噪呤核香磷酸化酶的方法，对设备 和操作技术要求苛刻，存在耗能多、耗时长，并且所得到的噤呤核苦磷酸化酶 产品活性仍有待提高的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有的液体发酵枯草芽孢杆菌制备噤呤核苦磷酸化 酶的方法，对设备和操作技术要求苛刻，存在耗能多、耗时长，并且所得到的 嘌呤核苷磷酸化酶产品活性仍有待提高的缺点，提供一种耗能少，耗时少，得 到的噤呤核苷磷酸化酶产品活性高的固态发酵制备噤呤核香磷酸化酶。现有技术一般认为液态发酵枯草芽孢杆菌较固态发酵枯草芽孢杆菌更易从中分离嘌呤核普磷酸化酶产品，因此能够更高效并以更简单的工艺来生产的 噤呤核苷磷酸化酶。本专利技术的专利技术人克服了现有技术的上述偏见，大胆地使用 固态发酵枯草芽孢杆菌来制备噤呤核芬磷酸化酶产品，并且采用颗粒直径为20-40目、含水量30%的无霉变玉米芯灭菌后作为固态发酵培养基的固体基质，结合独特的工艺，不仅没有出现分离困难的问题，而且以更低的设备要求、更 小的能耗、高效地实现了高活性嘌呤核普磷酸化酶的生产。本专利技术提供了 一种固态发酵枯草芽孢杆菌以制备。票呤核苷磷酸化酶的方法，其中，所述方法包括以下步骤 1 )制备玉米芯固体基质将无霉变玉米芯粉碎后过20目筛收集筛下物，然后将所收集的筛下物过 40目筛收集筛上物，得到20-40目颗粒直径的玉米芯固体基质； 使所得玉米芯固体基质水分含量达30重量％; 116-120。C灭菌60分钟； 2)配制培养基的液体部分 按照以下组分含量表配制培养基的液体部分蛋白胨5-50酵母粉2-50蔗糖0.5-5.0碳酸4丐5-100肌香5-10硫酸铵1.0-4.0磷酸氢二钠1.0-3.0磷酸二氬钾1.0-3.0七水辟u酸賴0.05-0.1pH5.0-7.5其中，溶剂为水，单位为每升水中含有的克数，配制好的液体部分在116。C下灭菌20分钟；3)制备固体培养基并接种枯草芽孢杆菌种子液在无菌条件下，将以下a)、 b)和c)混合a) 已经冷却至枯草芽孢杆菌能存活的温度的步骤l)得到的固体基质，b) 已经冷却至枯草芽孢杆菌能存活的温度的步骤2)得到的液体部分，c) 细胞密度为10M()S个/ml的枯草芽孢杆菌种子液，其中，a)和b)的重量比范围为1: 1.7至1: 2.2, c)占a)与b)之和 的5-10重量％;所得混合物以l-5厘米的厚度，在温度为25-36。C、湿度为70-90%、氧气 浓度为环境空气中氧气浓度的l-2倍的条件下发酵15-24小时；4) 分离玉米芯固体基质i) 将步骤3)得到的发酵产物与浸提液按照1: 2.5至1: 3.0的重量比混 合，浸提20-60分钟，然后搅拌至形成均匀分散体，其中，所述浸提液为含1% 氯化钠的pH 7.6的0.1M的磷酸钾緩沖液；ii) 将步骤i)所得均匀分散体通过40目不锈钢滤网过滤，分别收集滤液 和滤法；iii) 将步骤ii)所收集滤液在8000G下离心25分钟，分别收集上清液和 细月包沉淀；iv) 取步骤iii)所收集的上清液与步骤ii)所述滤渣，重复上述步骤i) 至步骤iii)三次，v )用pH 7.6的0.1M的磷酸钾緩沖液重悬步骤iii)和步骤iv )得到的细 胞沉淀，合并所得细胞重悬液，其中，所述pH7.6的0.1M的磷酸钾緩沖液与 步骤3)得到的发酵产物的重量比为1: 1至1: 3;5) 破碎细胞将步骤4)得到的细胞重悬液用高压匀浆机在600-850巴的条件下匀浆， 所得匀浆液在8000G下离心15分钟，收集上清即粗酶液；6) 酶的纯化对步骤5 )得到的粗酶液进行以下A )和/或B )的操作 A)在50-60。C下热处理10-50分钟；B )加入碌J臾铵使其终浓度达10-20%静置1-4小时，在8000G下离心20-30 分钟，收集上清，弃去沉淀；在所收集的上清中继续加入硫酸铵使其终浓度达 25-30%静置1-4小时，在8000G下离心20-30分钟，弃去上清，收集沉淀；其中，I) 单独进行A )操作后，将所得悬浮液在15000G下离心25-30分钟，收 集上清，弃去沉淀；II) 单独进行B)操作后，将所得沉淀用l-3倍体积的、pH值为7.5的100mM 的Tris-HCl緩冲液复溶；m)先完成A)操作时，将所得悬浮液在15000G下离心25-30分钟，收 集上清，弃去沉淀；然后进行B)搡作，最后将所得沉淀用l-3倍体积的、pH 值为7.5的100mM的Tris-HCl緩冲液复溶；或者IV)先完成B)操作时，将所得沉淀用l-3倍体积的、pH值为7.5的100mM 的Tris-HCl緩冲液复溶；然后进行A)操作，最后将所得悬浮液在15000G下 离心25-30分钟，收集上清，弃去沉淀；7) 酶液的脱盐将上述步骤6 )中I)或IV )最终收集的上清或者II)或III)得到的重悬 液用孔径为0.22-0.8 jum的滤膜过滤，收集滤液在4'C下保存；葡聚糖凝胶G-25脱盐柱经pH值为7.5的50mM的Tris-HCl缓沖液过夜 平衡后，用线性流速L9厘米/分钟的速度将上样所述4。C下保存的保存滤液， 并用pH值为7.5的50mM的Tris-HCl IC沖液以2.8厘米/分钟的速度洗脱，收 集吸收波长在280nm处的蛋白单峰，合并吸收值在20%峰高以上的组分；8) 酶的冻干将步骤7)收集到的组分加入甘露醇至其终浓度达0.5%,在零下35。C到 零下4(TC之间冷冻升华干燥至恒重即得。票呤核苷磷酸化酶干粉。本专利技术的方法采用颗粒直径为20-40目、含水量30%的无霉变玉米芯灭菌 后作为固态发酵培养基的固体基质，该具有特定颗粒直径和含水量的固体基质 在灭菌条件下，能够膨胀至合理的大小和疏松度，颗粒表面吸附足够的培养基 液体部分，以供枯草芽孢杆菌发酵。更重要的是，固态发酵培养基的固体基质 颗粒表面氧的传质阻力较小，仅静置培养无需额外搅拌，菌体生长致密，单位 体积的生产效率较高，能耗和人工费用也比较低。因此，使用本专利技术的固态发 酵方法可以实现从枯草芽孢杆菌中更高效分离嘌呤核苷磷酸化酶产品。并且本 专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固态发酵枯草芽孢杆菌以制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：　１）制备玉米芯固体基质　将无霉变玉米芯粉碎后过２０目筛收集筛下物，然后将所收集的筛下物过４０目筛收集筛上物，得到２０－４０目颗粒直径的玉米芯固体基 质；　使所得玉米芯固体基质水分含量达３０重量％；　１１６－１２０℃灭菌６０分钟；　２）配制培养基的液体部分按照以下组分含量表配制培养基的液体部分：　蛋白胨　５－５０酵母粉　２－５０　蔗糖　０．５－５．０碳酸钙　５－１００　肌苷　 ５－１０硫酸铵　１．０－４．０　磷酸氢二钠　１．０－３．０磷酸二氢钾　１．０－３．０　七水硫酸镁　０．０５－０．１　ｐＨ　５．０－７．５　其中，溶剂为水，单位为每升水中含有的克数，　配制好的液体部分在１１６℃下灭菌２０分钟；　３） 制备固体培养基并接种枯草芽孢杆菌种子液　在无菌条件下，将以下ａ）、ｂ）和ｃ）混合：　ａ）已经冷却至枯草芽孢杆菌能存活的温度的步骤１）得到的固体基质，　ｂ）已经冷却至枯草芽孢杆菌能存活的温度的步骤２）得到的液体部分，　ｃ）细胞密度为１ ０↑［５］－１０↑［８］个／ｍｌ的枯草芽孢杆菌种子液，　其中，ａ）和ｂ）的重量比范围为１∶１．７至１∶２．２，ｃ）占ａ）与ｂ）之和的５－１０重量％；　所得混合物以１－５厘米的厚度，在温度为２５－３６℃、湿度为７０－９０％、氧气浓度为环境 空气中氧气浓度的１－２倍的条件下发酵１５－２４小时；　４）分离玉米芯固体基质　ｉ）将步骤３）得到的发酵产物与浸提液按照１∶２．５至１∶３．０的重量比混合，浸提２０－６０分钟，然后搅拌至形成均匀分散体，其中，所述浸提液为含１％氯化钠的ｐＨ 　７．６的０．１Ｍ的磷酸钾缓冲液；　ｉｉ）将步骤ｉ）所得均匀分散体通过４０目不锈钢滤网过滤，分别收集滤液和滤渣；　ｉｉｉ）将步骤ｉｉ）所收集滤液在８０００Ｇ下离心２５分钟，分别收集上清液和细胞沉淀；　ｉｖ）取步骤ｉｉｉ）所收集的上清液 与步骤ｉｉ）所述滤渣，重复上述步骤ｉ）至步骤ｉｉｉ）三次，　ｖ）用ｐＨ　７．６的０．１Ｍ的磷酸钾缓冲液重悬步骤ｉｉｉ）和步骤ｉｖ）得到的细胞沉淀，并合所得细胞重悬液，其中，所述ｐＨ　７．６的０．１Ｍ的磷酸钾缓冲液与步骤３）得到的发酵产物的 重量比为１∶１至１∶３；　５）破碎细胞　将步骤４）得到的细胞重悬液用高压匀浆机在６００－８５０巴的条件下匀浆，所得匀浆液在８０...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：
申请(专利权)人：北京利德曼生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]