本申请属于微生物发酵领域，具体涉及产香草醛大肠杆菌工程菌株的构建方法及应用。首先提供了一种生产香草醛的大肠杆菌工程菌株，包括过表达的肉桂酰辅酶A还原酶ccr、香草醇氧化酶vaoA、松柏醇脱氢酶calA、烯酰辅酶A水合酶ech和柠檬酸合酶gltA或以上各酶的同工酶；及基因组中敲除氧化还原酶基因yjgB、yqhD、胆碱脱氢酶基因betA和ptsH基因中的一个或多个或与以上基因功能相同的基因中的一个或多个；以及肉桂酰辅酶A还原酶ccr的第49位精氨酸突变为了异亮氨酸或亮氨酸或缬氨酸，第55位赖氨酸突变为了丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸。本申请还提供了产香草醛大肠杆菌菌株的构建方法和利用菌株制备香草醛的方法。获得的菌株在优化通路和发酵条件后得到的香草醛产量达到22.5mM。和发酵条件后得到的香草醛产量达到22.5mM。和发酵条件后得到的香草醛产量达到22.5mM。
【技术实现步骤摘要】
一种生产香草醛和阿魏酰辅酶A的菌株和构建方法及应用
[0001]本申请属于涉及生物工程领域，特别是涉及一种生产阿魏酰辅酶A的方法和利用该方法的细菌菌株及构建方法。
技术介绍
[0002]阿魏酰辅酶A属于羟基肉桂酰酯类，是植物细胞中重要的活性前体，也是很多高价值化合物生产的前体，例如香草醛、姜黄素和东莨菪亭等。2000年，Obel等人从小麦幼苗中提取粗酶液，并证明该粗酶液兼具辅酶A连接酶活性、咖啡酸甲基转移酶活性和咖啡酰辅酶A甲基转移酶活性，可以直接将咖啡酸转化为阿魏酰辅酶A。随着研究的深入，生物合成阿魏酰辅酶A的途径被阐明。阿魏酸在4
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香豆酸辅酶A连接酶(4CL)的催化下也可以直接转化为阿魏酰辅酶A。另外，对香豆酸在4CL的催化下生成对香豆酸辅酶A，后者在对香豆酰莽草酸酯转移酶(CST)、对香豆酰
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O
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莽草酸酯羟化酶(CS3
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H)和咖啡酰辅酶A
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O
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甲基转移酶(CCoAOMT)的催化下转化生成阿魏酰辅酶A，但由于酚羟基甲基化的效率低，所以阿魏酸成为了合成阿魏酰辅酶A的首选底物，进而也是生物合成下游产物香草醛和姜黄素的主要底物。
[0003]以阿魏酸为底物经过阿魏酰辅酶A进而合成香草醛、姜黄素等高价值小分子时不需要经过宿主的中心代谢途径，不会影响宿主菌的生长状况。如，阿魏酸在阿魏酰辅酶A合成酶(Fcs)的催化下生成阿魏酰辅酶A，后者可以被烯酰辅酶A水合酶(Ech)继续催化为香草醛。自然界中存在多种能将阿魏酸转化为香草醛的菌株。2011年Di Gioia等沉默了Pseudomonas fluorescens菌株内香草醛脱氢酶基因vdh，同时引入多拷贝的fcs和ech，最终在8h得到1.28g/L香草醛。Fleige等采用相同的策略，利用Actinomycete Amycolatopsis sp.菌株全面优化条件后，获得22.3g/L香草醛。尽管，利用以上菌株可以获得较多香草醛，但这些菌株都会形成密集的菌丝，导致发酵液粘稠，也给后续分离提取工作造成困难。利用大肠杆菌发酵可以避免菌丝带来的困扰，2008年，有研究人员对大肠杆菌基因组进行改造，优化细胞内辅酶A的积累量，最终在2YT培养基中培养24h获得5.14g/L香草醛。自然界中还存在另一条不消耗辅酶A合成通路，2018年，Ni等人在大肠杆菌中异源表达Bacillus coagulans DSM1来源的酚酸脱羧酶(Pad)和Thermothelomyces thermophila来源的苯酚单氧酶(Ado)，在1L的反应体系中18h生成13.3g/L香草醛，这是目前利用重组大肠杆菌生产香草醛的最高产量。但此途径在反应过程中会生成甲醛，导致生成的香草醛无法直接应用于食品和医药领域。
[0004]另外，丁香酚也是合成香草醛的重要的底物之一。丁香酚是丁香油的主要成分，可以在工业规模上直接从丁香油中分离得到，所以价格低廉。在铜绿假单胞菌中，丁香酚被丁香酚羟化酶(EhyA和EhyB)、松柏醇脱氢酶(CalA)和松柏醛脱氢酶(CalB)先后催化为阿魏酸。生成的阿魏酸可以被继续转化为香草醛。2003年，Overhage J等人将通路中的丁香酚羟化酶基因ehyAB替换为了penicillium simplicissimum CBS 170.90来源的香草醇氧化酶基因vaoA，结合上述提到的阿魏酸
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香草醛途径，先后利用两个大肠杆菌菌株，经过两步反
应实现了从丁香酚到香草醛的生物转化。该方法虽然生成了0.3g/L的香草醛，但是由于第二步反应的转化效率过低，培养液中剩余大量的阿魏酸，延长反应时间后，不仅剩余的阿魏酸没有被转化为香草醛，已经生成的香草醛还被全部还原成香草醇。
[0005]异丁香酚作为丁香酚的同分异构体，也可以被生物转化为香草醛。孙志浩等人从土壤中分离得到的纺锤芽胞杆菌可以在以异丁香酚为唯一碳源的平板上生长，将异丁香酚放入发酵液或游离细胞或固定化细胞中，1
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4天可转化生成2
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4g/L香草醛。在水
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有机相双相体系中反应3天，可在有机相中检测到32.5g/L香草醛。随后，赵丽青等人进一步优化转化条件，反应3天后，获得46g/L香草醛。该方法与上述利用Actinomycete Amycolatopsis sp.菌株转化阿魏酸生成香草醛的方法类似，都会在发酵过程中形成菌丝，给后续分离纯化工作造成困扰。以上方法虽然能生产香草醛但都有很大的缺陷，因此，亟需一种成本低、方法简单、高效通过丁香酚生产香草醛的方法。
技术实现思路
[0006]为了实现以上目的，本申请提供了一种利用丁香酚在细菌中生产阿魏酰辅酶A和香草醛的菌株和菌株的构建方法及利用菌株合成阿魏酰辅酶A和香草醛的方法。
[0007]以下为具体
技术实现思路
：
[0008]首先，本申请提供一种生产香草醛的菌株，菌株具有：
[0009]过表达的肉桂酰辅酶A还原酶CCR或同工酶、香草醇氧化酶VaoA或同工酶、松柏醇脱氢酶CalA或同工酶、烯酰辅酶A水合酶Ech或同工酶和柠檬酸合酶因GltA或同工酶。
[0010]以上所述菌株的基因组中还缺失氧化还原酶基因yjgB、yqhD、胆碱脱氢酶基因betA和ptsH基因中的一个或多个或与以上基因功能相同的基因中的一个或多个；及肉桂酰辅酶A还原酶CCR，优选为银合欢来源的Ll
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CCRH1。
[0011]进一步地，肉桂酰辅酶A还原酶具有如下突变中的一种或多种：
[0012]第49位精氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸或缬氨酸；第55位赖氨酸突变为丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸；第51位的脯氨酸变为丝氨酸；第26位的甘氨酸变为谷氨酸；第48位的丙氨酸变为天冬氨酸。
[0013]本申请还提供了包含上述菌株的产品以及该菌株在生产香草醛中的应用。
[0014]进一步地，本申请提供了产香草醛的菌株的构建方法，具体如下：先敲除菌株基因组上的氧化还原酶基因yjgB基因和yqhD基因及胆碱脱氢酶基因betA基因和ptsH基因；然后，在菌株基因组中插入119启动子后的柠檬酸合酶基因gltA；
[0015]然后，再构建含有ccr、vaoA、calA和ech基因的质粒，将各个质粒转化到大肠杆菌中得到
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yjgB
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yqhD
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betA
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ptsH
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119
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gltA菌株。
[0016]上述的构建方法，还包括对肉桂酰辅酶A还原酶的定向进化，以下为具体内容：
[0017]将所述ccr基因进行突变构建突变文库，筛选得到一个肉桂酰辅酶A还原酶的第49位精氨酸突变为了异亮氨酸或亮氨酸或缬氨酸，第55位赖氨酸突变为了丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸，第51位的脯氨酸变为丝氨酸；第26位的甘氨酸变为谷氨酸；第48位的丙氨酸变为天冬氨酸的突变体。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种生产香草醛的菌株，菌株具有：过表达的肉桂酰辅酶A还原酶CCR或同工酶、香草醇氧化酶VaoA或同工酶、松柏醇脱氢酶CalA或同工酶、烯酰辅酶A水合酶Ech或同工酶和柠檬酸合酶因GltA或同工酶。2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，菌株的基因组中缺失氧化还原酶基因yjgB、yqhD、胆碱脱氢酶基因betA、ptsH基因中的一个或多个或与以上基因功能相同的基因中的一个或多个；及肉桂酰辅酶A还原酶CCR，优选为银合欢来源的Ll
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CCRH1。3.根据权利要求2所述的菌株，其特征在于，所述肉桂酰辅酶A还原酶具有如下突变中的一种或多种：第49位精氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸或缬氨酸；第55位赖氨酸突变为丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸；第51位的脯氨酸变为丝氨酸；第26位的甘氨酸变为谷氨酸；第48位的丙氨酸变为天冬氨酸。4.一种包含权利要求1
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3任一项所述菌株的产品及菌株在生产香草醛中的应用。5.一种如权利要求1
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3任一项所述菌株的构建方法，其特征在于，包括：先敲除菌株基因组上的氧化还原酶基因yjgB基因和yqhD基因及胆碱脱氢酶基因betA基因和ptsH基因；然后，在菌株基因组中插入柠檬酸合酶gltA基因；再构建含有ccr、vaoA、calA和ech基因的质粒，将各个质粒转化到宿主菌中得到
△‑
yjgB
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yqhD
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betA
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ptsH
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gltA菌株；再将所述肉桂酰辅酶A还原酶CCR基因突变，使肉桂酰辅酶A还原酶的第49位精氨酸突变为了异亮氨酸或亮氨酸或缬氨酸，第55位赖氨酸突变为丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸；第51位的脯氨酸变为丝氨酸；第26位的甘氨酸变为谷氨酸；第48位的丙氨酸变为天冬氨酸；其中，所述菌株为大肠杆菌，优选为，为K12系列菌株，进一步优选为，大肠杆菌BW25113。6.一种使用权利要求1
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3任一项所述的菌株制备香草醛的方法，其特征在于，将构建好的含有ccr、vaoA、calA和ech的质粒转化到所述
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yjgB
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yqhD
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betA
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ptsH
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gltA菌株中，挑取单菌落到含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB培养基试管内，在37℃培养，得到培养液；以所述培养液作为种子液，按照1体积％的比例转接到含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB摇瓶中，37℃培养，当OD
600
＝0.6
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0.8时加入IPTG诱导香草醛蛋白表达，30℃培养，离心收集菌体后重悬；取重悬后的菌液到摇瓶中，30℃震荡培养，根据底物松柏醛的消耗情况，流加丁香酚到摇瓶中；优选为，将构建好的含有ccr、vaoA、calA和ech的质粒转化到所述
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yjgB
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yqhD
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betA
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gltA菌株中，挑取单菌落到含有50ug/ml卡那霉素和100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基试管内，在37℃,220rpm震荡培养12h，得到培养液；再以所述培养液作为种子液，按照1％的体积比例转接到含有50ug/ml卡那霉素和100ug/ml氨苄青霉素的100ml LB培养基的摇瓶中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱小冲，梁朝宁，唐双焱，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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