一种单碱基突变耐药菌的可视化检测技术制造技术

本发明专利技术公开了一种单碱基突变耐药菌的可视化检测技术，属于核酸检测领域。利用ARMS

【技术实现步骤摘要】
一种单碱基突变耐药菌的可视化检测技术


[0001]本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种单碱基突变耐药菌的可视化检测技术。

技术介绍

[0002]近年来，全世界各地经常从家禽养殖场、食品加工厂和市售蛋禽类制品中分离得到耐药沙门氏菌。由于环境的复杂性，甚至能够诱发多重耐药，其出现是过度使用抗生素及病原菌变异的结果。耐药沙门氏菌会严重影响临床上的治疗与防控，并且会增加治疗费用和副作用风险。沙门氏菌对抗抗生素的耐药机制复杂，其中由于单碱基突变诱发的耐药性获得在沙门氏菌中很常见，喹诺酮类耐药主要是由于喹诺酮耐药决定区（quinolone resistance
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determining region, QRDR）基因突变导致。DNA促旋酶是喹诺酮类药物的主要作用靶位，由2个GyrA亚基和2个GyrB亚基组成，分别由gyrA和gyrB基因编码。一旦gyrA发生基因突变，会引发DNA促旋酶的QRDR发生氨基酸突变，能够引起酶结构和功能的变化，从而干扰喹诺酮药物结合靶位，减少病原菌对抗生素的敏感性，因此导致耐药菌的产生。鉴于环境诱发的基因单碱基突变造成的耐药细菌对食品安全防控造成了严重威胁，检测耐药菌的单碱基突变基因，了解沙门氏菌耐药性的产生和传播意义重大。
[0003]目前针对基因单碱基突变的最常用方法仍然是二代测序，但是二代测序比较繁琐，耗时较长，测得结果包含大量的无关序列。由于碱基突变的低丰度（<1%）以及单碱基突变对核酸结构改变的影响较少，因此在开发用于高灵敏和高选择性的单碱基突变检测技术上还存在很大挑战。突变扩增系统（amplification refractory mutation system
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PCR, ARMS
‑
PCR）作为检测单碱基突变的有效手段，已广泛应用于临床实践中，并且该技术适宜与其他功能核酸或者信号输出手段相结合。目前利用ARMS
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PCR进行检测的手段主要是基于ARMS
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qPCR，即需要借助复杂的实时荧光测量仪器，不利于现场快速检测。
[0004]目前尚未见到ARMS
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PCR与CRISPR/Cas12a体系结合用于检测耐药单碱基突变的可视化检测技术。

技术实现思路

[0005]针对耐药突变基因现有检测技术中的不足，本专利技术提供一种单碱基突变耐药菌的可视化检测技术，整合了ARMS
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PCR扩增、CRISPR
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Cas12a系统和G
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四链体报告系统，允许快速和特异性地对耐药单碱基突变进行识别，并输出可视化的信号。
[0006]本专利技术所述的单碱基突变耐药菌的可视化检测技术具体检测步骤如下：（1）提取扩增，从待测样品中提取基因组DNA，并将提取到的待检DNA样品加入ARMS
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PCR系统进行核酸扩增，用于扩增的ARMS
‑
PCR体系中包含识别耐药单碱基突变的特异引物；（2）CRISPR/Cas12a反应，对扩增产物进行CRISPR/Cas12a识别和切割，Cas12a反应体系包括Cas12a缓冲液、Cas12a效应蛋白、gRNA、G
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四链体序列和ARMS
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PCR扩增产物溶液；
（3）可视化信号输出，向步骤（2）反应液中加入血红素（Hemin）、KCl、3,3',5,5'
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四甲基联苯胺（TMB），通过颜色变化来判断待检样品中是否存在目标单碱基突变耐药基因，利用酶标仪检测反应后的吸光度，通过吸光度的变化对目标单碱基突变耐药基因进行定量。
[0007]本方法能够对含有目标耐药突变基因的DNA样品进行特异性识别，通过可视化信号输出迅速判读耐药突变基因检测结果。
[0008]进一步地，ARMS
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PCR扩增所需的前引物ARMS
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F的3
’
末端的1~5位人为引入了错配，以增强对单碱基突变识别的特异性。
[0009]进一步地，所述ARMS
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PCR扩增所需的特异性引物ARMS
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F和ARMS
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R序列分别如SEQ ID NO.1~6和SEQ ID NO.7所示。
[0010]进一步地，所述ARMS
‑
PCR反应体系总体积为20 μL，包含1~10 μM前引物ARMS
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F、1~10 μM后引物ARMS
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R、1~3
×
预混PCR反应液、0.3 pg/mL~10 pg/mL的目标DNA和分子水。
[0011]进一步地，所述ARMS
‑
PCR的循环程序包括在95 ℃下初始变性5 min，之后进行24个循环（95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s）。
[0012]进一步地，所述Cas12a反应体系先在包含Cas12a缓冲液，0.2~2 μM gRNA，0.1~0.5 μM Cas12a效应蛋白和分子水的体系里常温下反应5~15 min，然后再往体系里添加1~5 μL ARMS
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PCR扩增产物溶液，0.5~1 μM G
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四链体序列，在37
ꢀ°
C下孵育45~60 min。
[0013]进一步地，所述Cas12a效应蛋白是Cas12a或具有与Cas12a的反式切割活性类似的Cas蛋白。
[0014]进一步地，所述gRNA为一段RNA，用于引导Cas12a效应蛋白特异性结合目标DNA分子，序列如SEQ ID NO.8~12所示；前述gRNA可通过体外转录获得。
[0015]进一步地，所述G
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四链体在结构完整时可以结合血红素，具有过氧化物酶活性，并催化TMB显示出蓝绿色。
[0016]进一步地，所述G
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四链体序列如SEQ ID NO.13~18所示。
[0017]进一步地，所述可视化检测可用于定性检测或定量检测。其中，定性检测是指通过溶液颜色发生改变进行可视化检测，定量检测借助吸光度检测设备进行检测。
[0018]本方法检测原理如图1所示。为了实现耐药基因gyrA的单碱基突变高灵敏度可视化检测，我们整合了ARMS
‑
PCR扩增、CRISPR
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Cas12a系统和G
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四链体报告系统。首先提取沙门氏菌的DNA，通过在引物优化了错配位点后的ARMS
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PCR系统进行核酸扩增，然后通过CRISPR
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Cas12a系统对PCR扩增子进行鉴定。ARMS
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PCR的错配引物和Cas12a的gRNA进行了双重识别，保证了目标的特异性，并提高了检测灵敏度。在可视化信号输出中，扩增产物可以激活Cas12a的反式切割活性，使其切割单链G
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单碱基突变耐药菌的可视化检测技术，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取扩增，从待测样品中提取基因组DNA，并将提取到的待检DNA样品加入ARMS
‑
PCR系统进行核酸扩增，用于扩增的ARMS
‑
PCR体系中包含识别耐药单碱基突变的特异引物；（2）CRISPR/Cas12a反应，对扩增产物进行CRISPR/Cas12a识别和切割，Cas12a反应体系包括Cas12a缓冲液、Cas12a效应蛋白、gRNA、G
‑
四链体序列和ARMS
‑
PCR扩增产物溶液；（3）可视化信号输出，向步骤（2）反应液中加入血红素（Hemin）、KCl、3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺（TMB），通过颜色变化来判断待检样品中是否存在目标单碱基突变耐药基因，利用酶标仪检测反应后的吸光度，通过吸光度的变化对目标单碱基突变耐药基因进行定量。2.根据权利要求1所述的可视化检测技术，其特征在于，所述ARMS
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PCR扩增所需的前引物ARMS
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F的3
’
末端的1~5位人为引入了错配，以增强对单碱基突变识别的特异性。3.根据权利要求1所述的可视化检测技术，其特征在于，所述ARMS
‑
PCR扩增所需的特异性引物ARMS
‑
F和ARMS
‑
R序列分别如SEQ ID NO.1~6和SEQ ID NO.7所示。4.根据权利要求1所述的可视化检测技术，其特征在于，所述ARMS
‑
PCR反应体系总体积为20 μL，包含1~10 μM前引物ARMS
‑
F、1~10 μM后引物ARMS
‑
R、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕远平，朱宇琳，邓锐杰，杨森，夏许寒，何强，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：