重组人生长激素-Fc融合蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术提出了重组人生长激素

【技术实现步骤摘要】
重组人生长激素
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Fc融合蛋白的纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物领域。具体地，本专利技术涉及重组人生长激素
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Fc融合蛋白的纯化方法。

技术介绍

[0002]人生长激素(human growth hormone，hGH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种非糖基化的蛋白质激素，是人类出生后促进生长的最重要的激素，具有调节人体生长代谢等多重功能。重组人生长激素
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Fc融合蛋白(recombinant hGH
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Fc，rhGH
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Fc)是利用重组DNA技术，由2个结构和氨基酸序列与天然的hGH一致的分子加上2个免疫球蛋白的Fc段形成。rhGH
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Fc融合蛋白被广泛用于成人和儿童的生长激素缺乏症，因增加了Fc段使得重组人生长激素在体内能更长时间发挥作用，减少注射次数。
[0003]在rhGH
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Fc融合蛋白纯化工艺中，由于天然的人生长激素分子序列的相关特性，导致在纯化的过程中出现不断析出蛋白现象，即便是过滤除去蛋白后仍会持续析出，使得纯化过程无法继续，难以持续稳定地生产出符合质量要求的产品。rhGH
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Fc融合蛋白析出现象在纯化工艺放大时尤为明显，极大地制约着纯化工艺的规模化放大生产。
[0004]因此，目前的重组人生长激素
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Fc融合蛋白的纯化方法仍有待研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本专利技术提出了重组人生长激素
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Fc融合蛋白的纯化方法，利用该方法可以有效地提高rhGH
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Fc融合蛋白收率，获得的纯化产品中rhGH
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Fc融合蛋白纯度高、HCP蛋白等杂质少，质量符合要求，具有工艺步骤简单、效率高和可规模化放大等特点，应用价值高。
[0006]本专利技术是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
[0007]rhGH
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Fc融合蛋白中的Fc可以作为标签，通过亲和层析可以实现分离目的。为了解决蛋白析出的问题，本专利技术的专利技术人尝试在亲和层析的洗脱液中添加促溶剂，对不同促溶剂进行了研究，发现一些促溶剂并不能够抑制蛋白析出，或者虽然有抑制作用，但是效果并不突出。经过深入研究和筛选发现，采用泊洛沙姆188可以有效地抑制蛋白析出，洗脱后的蛋白流出液澄清，有助于纯化工艺顺利进行，保证蛋白收率，可实现规模化放大生产。另外，后续将rhGH
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Fc融合蛋白制成制剂的过程中若需要添加泊洛沙姆188，则由于纯化产物中保留有泊洛沙姆188，使得后续可以减少或者省去泊洛沙姆188，整体上降低了生产成本和生产效率。
[0008]进一步地，专利技术人尝试将经亲和层析分离出的含rhGH
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Fc融合蛋白的流出液进行离子交换层析。文献报道细胞宿主蛋白HCP等电点范围在4.5～7.0之间，而目的蛋白rhGH等电点约为6.0，与HCP等电点接近，这使得离子交换层析很难充分地分离除去HCP，纯化产物中HCP含量过高。进而，专利技术人尝试在亲和层析中尽可能地除去HCP，以便缓解下一阶段离子交换层析的压力。
[0009]有鉴于此，专利技术人经过大量实验发现，在亲和层析的冲洗缓冲液中添加辛酸钠，可以有效地除去HCP。进一步地，专利技术人发现辛酸钠在酸性条件下容易出现沉淀析出，而洗脱液的pH值呈酸性，若将含有辛酸钠的缓冲液冲洗亲和层析柱后直接用洗脱液洗脱，则流出液中会出现辛酸钠沉淀，影响后续工艺。进而，专利技术人在用含有辛酸钠的缓冲液冲洗层析柱前后均采用偏碱性的冲洗缓冲液冲洗层析柱，由此，可以有效地避免辛酸钠出现沉淀，保证了纯化工艺顺利进行，减少纯化产物中的杂质含量。
[0010]为此，本专利技术提出了一种重组人生长激素
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Fc融合蛋白的纯化方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将含有重组人生长激素
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Fc融合蛋白的细胞液进行过滤，收集滤液；将所述滤液进行亲和层析；其中，所述亲和层析采用的洗脱液中含有泊洛沙姆188。
[0011]根据本专利技术实施例的方法中，通过在洗脱液中添加泊洛沙姆188，可以有效地避免rhGH
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Fc融合蛋白析出，有助于纯化工艺顺利进行，保证蛋白收率，可实现规模化放大生产。
[0012]根据本专利技术的实施例，上述重组人生长激素
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Fc融合蛋白的纯化方法还可以具有下列附加技术特征至少之一：
[0013]根据本专利技术的实施例，所述亲和层析采用的填料选自Protein A。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述洗脱液中泊洛沙姆188含量大于0.03体积％，优选0.04～0.50体积％。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述洗脱液的pH值为3.0～4.5，优选3.2～3.8。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述洗脱液中含有酸和碱，所述酸选自醋酸、柠檬酸体系、甘氨酸、盐酸、磷酸、硫酸中的至少一种，优选醋酸；所述碱选自氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸氢二钠、精氨酸、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸钠、硫酸铵中的至少一种，优选氢氧化钠。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述亲和层析包括：依次利用第一缓冲液和洗脱液冲洗亲和层析柱；所述第一缓冲液中含有辛酸钠。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述第一缓冲液的pH值为7.0～9.0，优选7.0～7.5。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述第一缓冲液中辛酸钠的浓度为50～150mM，优选80～120mM。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述第一缓冲液中含有磷酸盐。
[0021]根据本专利技术的实施例，所述亲和层析包括：a)利用第二缓冲液和第三缓冲液中的至少之一冲洗所述亲和层析柱；b)利用所述第一缓冲液冲洗所述亲和层析柱；c)利用第二缓冲液或第三缓冲液冲洗所述亲和层析柱；d)利用第四缓冲液冲洗所述亲和层析柱；e)利用所述洗脱液洗脱所述亲和层析柱，收集流出液；所述第二缓冲液的pH值为7.0～8.0，优选7.0～7.5；所述第三缓冲液的pH值为7.0～8.0，优选7.0～7.5；所述第四缓冲液的pH值为4.0～6.0，优选5.2～5.8。
[0022]根据本专利技术的实施例，所述第二缓冲液选自磷酸盐缓冲液，所述第三缓冲液选自含有氯化钠的磷酸盐缓冲液，所述第四缓冲液中含有酸和碱。
[0023]根据本专利技术的实施例，所述酸选自醋酸、柠檬酸体系、甘氨酸、盐酸、磷酸、硫酸中的至少一种，优选醋酸；所述碱选自氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸氢二钠、精氨酸、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸钠、硫酸铵中的至少一种，优选氢氧化钠。
[0024]根据本专利技术的实施例，步骤a)中，所述第二缓冲液和第三缓冲液中的至少之一的
冲洗总量不少于3倍柱体积，线性流速为60～120cm/h。
[0025]根据本专利技术的实施例，步骤b)中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人生长激素
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Fc融合蛋白的纯化方法，其特征在于，包括：将含有重组人生长激素
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Fc融合蛋白的细胞液进行过滤，收集滤液；将所述滤液进行亲和层析；其中，所述亲和层析采用的洗脱液中含有泊洛沙姆188。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析采用的填料选自Protein A。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱液中泊洛沙姆188含量为大于0.03体积％，优选0.04～0.50体积％；任选地，所述洗脱液的pH值为3.0～4.5，优选3.2～3.8；任选地，所述洗脱液中含有酸和碱，所述酸选自醋酸、柠檬酸体系、甘氨酸、盐酸、磷酸、硫酸中的至少一种，优选醋酸；所述碱选自氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸氢二钠、精氨酸、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸钠、硫酸铵中的至少一种，优选氢氧化钠。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析包括：依次利用第一缓冲液和洗脱液冲洗亲和层析柱；所述第一缓冲液中含有辛酸钠；任选地，所述第一缓冲液的pH值为7.0～9.0，优选7.0～7.5；任选地，所述第一缓冲液中辛酸钠的浓度为50～150mM，优选80～120mM；任选地，所述第一缓冲液中含有磷酸盐。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述亲和层析包括：a)利用第二缓冲液和第三缓冲液中的至少之一冲洗所述亲和层析柱；b)利用所述第一缓冲液冲洗所述亲和层析柱；c)利用第二缓冲液或第三缓冲液冲洗所述亲和层析柱；d)利用第四缓冲液冲洗所述亲和层析柱；e)利用所述洗脱液洗脱所述亲和层析柱，收集流出液；所述第二缓冲液的pH值为7.0～8.0，优选7.0～7.5；所述第三缓冲液的pH值为7.0～8.0，优选7.0～7.5；所述第四缓冲液的pH值为4.0～6.0，优选5.2～5.8；任选地，所述第二缓冲液选自磷酸盐缓冲液，所述第三缓冲液选自含有氯化钠的磷酸盐缓冲液，所述第四缓冲液中含有酸和碱；任选地，所述酸选自醋酸、柠檬酸体系、甘氨酸、盐酸、磷酸、硫酸中的至少一种，优选醋酸；所述碱选自氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸氢二钠、精氨酸、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸钠、硫酸铵中的至少一种，优选氢氧化钠。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述第二缓冲液和第三缓冲液中的至少之一的冲洗总量不少于3倍柱体积，线性流速为60～120cm/h；任选地，步骤b)中，所述第一缓冲液的冲洗量不少于6倍柱体积，线性流速为120～180cm/h；任选地，步骤c)中，所述第二缓冲液或第三缓冲液的冲洗量不少于2倍柱体积，线性流速为120～180cm/h；任选地，步骤d)中，所述第四缓冲液的冲洗量不少于6倍柱体积，线性流速为120～180cm/h；任选地，步骤e)中，所述洗脱液的洗脱量不少于5倍柱体积，流速为线性流速为120～
180cm/h；任选地，步骤a)和b)之间，进一步包括：f)利用所述第二缓冲液或第三缓冲液冲洗所述亲和层析柱，冲洗量不少于3倍柱体积，线性流速为120～180cm/h。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：将采用所述洗脱液洗脱亲和层析柱所收集的流出液进行阴离子交换层析和阳离子疏水复合层析，收集含有重组人生长激素
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Fc融合蛋白的流出液；将所述含有重组人生长激素
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Fc融合蛋白的流出液进行纳滤，收集纳滤流出液；将所述纳滤流出液进行超滤，收集截留液，得到纯化的重组人生长激素
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Fc融合蛋白。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析采用的洗脱缓冲液中含有泊洛沙姆188，含量大于0.03体积％，优选0.04～0.50体积％；任选地，所述阴离子交换层析的洗脱过程中采用第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液进行梯度洗脱，所述第一洗脱缓冲液包括：L
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组氨酸和L
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盐酸组氨酸，pH值为6.6～7.0；所述第二洗脱缓冲液包括：L
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组氨酸、L
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盐酸组氨酸、氯化钠和泊洛沙姆188，pH值为6.6～7...

【专利技术属性】
技术研发人员：王骥，秦锁富，尹江峰，王博，黄慧瑜，
申请(专利权)人：深圳科兴药业有限公司，
类型：发明
国别省市：