黑曲霉脂肪酶及应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及酯化合成脂肪酸乙酯的黑曲霉脂肪酶及应用。针对现有技术适用于酒类酿造过程中，在水相体系下可催化合成脂肪酸乙酯的高效脂肪酶相对匮乏的问题，本发明专利技术提供一种来源于黑曲霉的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其能够催化合成多种不同链长的脂肪酸乙酯类香气物质，其中对庚酸乙酯的生成量和催化效率提高最为显著，为105mg/L和28％，因此，本发明专利技术提供的脂肪酶对于白酒酿造领域具有重要意义。于白酒酿造领域具有重要意义。于白酒酿造领域具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
黑曲霉脂肪酶及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及酯化合成脂肪酸乙酯的黑曲霉脂肪酶及应用。

技术介绍

[0002]脂肪酶(EC3.1.1.3)是三脂酰甘油水解酶类的统称，能够催化长链酰基甘油在脂质
‑
水界面分解为二酰基甘油酯、单甘油酯、甘油和游离脂肪酸。目前研究表明，脂肪酶还可以催化酯合成、酰胺化、醇解、酯交换等一系列反应，是一种重要的工业酶类，在食品、医药、纸浆、化妆品、饲料、洗涤等工业中有着广泛的应用。
[0003]多种挥发性物质包括酯类、醇类和醛类物质种类和含量的组合决定了白酒的质量和风格。其中，酯类物质是中国白酒最主要的风味物质，其含量占风味物质总量的40％～65％，脂肪酸乙酯是白酒中重要的风味化合物，其中己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯占总酯含量的90％以上，被称为形成白酒主要风味的四大酯。白酒中酯类物质的形成除酵母细胞代谢合成外，酶催化的酯化反应也是酯类物质形成的重要途径。脂肪酶可催化脂肪酸和乙醇酯化合成脂肪酸乙酯，但是，反应通常在有机相中进行，虽然有研究黑曲霉在水相中合成酯的能力，然而在白酒生产中，原料中有53～58％的水分，属于水相体系，但目前已报道的在水相体系下可催化合成脂肪酸乙酯的脂肪酶还非常有限，因而大大限制了脂肪酶在传统白酒酿造领域中的应用。

技术实现思路

[0004]针对现有技术适用于酒类酿造过程中，在水相体系下可催化合成脂肪酸乙酯的高效脂肪酶相对匮乏，需挖掘更多的酸性脂肪酶基因，使其在酿造领域发挥更大地应用价值。本专利技术提供一种来源于黑曲霉的脂肪酶，其能够催化合成多种不同链长的脂肪酸乙酯类香气物质，对于白酒酿造领域具有重要意义。
[0005]本专利技术首先提供黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]黑曲霉脂肪酶氨基酸序列SEQ ID NO.1：
[0007]VPMLQSRATSDPAEWTELHRAAQLSSAAYTGCTGSAFDVTITKQINELVGDTQGFIGYSTEKKRITVAMRGSTSATDIANDVDTTLVEPTLSGVNFPSGAKMMHGIYSPWSSVHDDVISEVKSLVEQYPDYTIESTGHSLGGSLTYISYIALAQNFPGKTIISNALAAYPIGNEAFANFGASQNGTLNRGNNADDGVPNMYVMWPWDFVHYGTEYYSSGTQASTVKCSGERDTSCSAGNGQVGVTAGHFSNFGIAMGMAGCSSSLLHHHHHH。
[0008]本专利技术还提供了编码所述黑曲霉脂肪酶的编码基因，如SEQ ID NO.2所示。
[0009]黑曲霉脂肪酶的编码基因SEQ ID NO.2：
[0010]GTTCCAATGTTGCAGTCTAGAGCCACCTCTGATCCAGCCGAGTGGACCGAATTGCATAGAGCCGCCCAGCTTAGTAGTGCTGCCTATACTGGTTGCACCGGATCTGCTTTCGACGTCACCATCACCAAGCAGATCAATGAGCTTGTCGGTGACACCCAAGGATTCATTGGATACTCTACCGAGAAAAAGAGGATCACCGTCGCCATGAGGGGTTCTACCT
CTGCCACCGATATCGCTAACGACGTCGATACCACCTTGGTCGAACCAACCTTGTCTGGAGTCAACTTCCCATCTGGAGCCAAGATGATGCACGGAATCTACAGTCCATGGTCTAGTGTCCACGACGACGTCATCTCTGAGGTCAAGTCTCTTGTTGAACAATACCCAGATTACACCATCGAGTCTACCGGACACTCTTTGGGAGGTTCTTTGACCTATATCTCTTACATCGCTTTGGCCCAGAACTTCCCCGGAAAGACCATCATCTCTAACGCCTTGGCTGCCTACCCAATCGGTAACGAAGCTTTCGCCAACTTCGGAGCCTCTCAGAACGGTACCTTGAATAGAGGAAACAACGCCGACGACGGTGTCCCTAACATGTACGTCATGTGGCCATGGGACTTCGTCCACTACGGTACCGAGTACTACAGTTCTGGTACTCAAGCTAGTACTGTCAAGTGCAGTGGAGAGAGAGACACTAGTTGCTCTGCCGGTAATGGTCAAGTCGGTGTCACTGCCGGACACTTCAGTAACTTCGGTATCGCCATGGGAATGGCCGGTTGCAGTAGTAGTTTGTTGCATCACCACCATCACCACTGA本专利技术还提供了上述黑曲霉脂肪酶在合成脂肪酸乙酯中的应用。
[0011]优选地，提供了上述黑曲霉脂肪酶在水相体系中催化合成脂肪酸乙酯中的应用。
[0012]本专利技术还提供了上述黑曲霉脂肪酶在制备含脂肪酸乙酯的酒用酯香液或白酒中的应用。
[0013]优选地，所述脂肪酸乙酯包括：丁酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯中至少一种。
[0014]其中，所述应用中，黑曲霉脂肪酶在水相体系中催化合成脂肪酸乙酯的反应条件为：pH自然，温度为40℃。
[0015]本专利技术还提供上述黑曲霉脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：构建含有所述黑曲霉脂肪酶编码基因的重组载体，将重组载体转入宿主细胞中，经过诱导表达、分离纯化获得。
[0016]优选地，所述重组载体为pET
‑
28a(+)。
[0017]优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0018]有益效果：本专利技术基于基因工程技术，从黑曲霉中获得一种脂肪酶基因，定义为黑曲霉脂肪酶Tgl，其可以很好地催化脂肪酸乙酯类香气物质的合成。本专利技术还进一步探究该脂肪酶对己酸乙酯等乙酯类香气物质的合成效率，其能为脂肪酶在酿造行业中广泛应用和工业化酶制剂种类的丰富提供理论基础。
[0019]本专利技术脂肪酶对六种不同链长的脂肪酸乙酯具有不同程度的酯化功能，其中对庚酸乙酯的生成量和催化效率提高最为显著，为105mg/L和28％。因此，该来源于黑曲霉的脂肪酶在调控白酒风味物质含量及产品品质方面具有很大的应用潜力。
附图说明
[0020]图1为本专利技术实施例1中菌液PCR结果验证；其中，泳道M为marker；泳道1，2是目的条带；
[0021]图2为本专利技术实施例2中重组蛋白的SDS
‑
PAGE分析图；其中，泳道M为marker；泳道1为20mmol/L洗脱液；2为40mmol/L洗脱液；
[0022]图3为本专利技术实施例3中黑曲霉脂肪酶的最适反应温度；
[0023]图4为本专利技术实施例3中黑曲霉脂肪酶的最适反应pH；
[0024]图5为本专利技术实施例4黑曲霉脂肪酶在60％乙醇浓度体系下合成脂肪酸乙酯的能力。
具体实施方式
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述黑曲霉脂肪酶的编码基因，其特征在于：如SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1或2所述黑曲霉脂肪酶在合成脂肪酸乙酯中的应用。4.权利要求1或2所述黑曲霉脂肪酶在水相体系中催化合成脂肪酸乙酯中的应用。5.权利要求1或2所述黑曲霉脂肪酶在制备含脂肪酸乙酯的酒用酯香液或白酒中的应用。6.根据权利要求3～5任一项所述应用，其特征在于：所述脂肪酸乙酯包括：丁酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯或辛酸乙酯中至少...

【专利技术属性】
技术研发人员：马立娟，王洪，赵东，刘怡宁，郑佳，
申请(专利权)人：宜宾五粮液股份有限公司，
类型：发明
国别省市：