用于预测FMT治疗SLE疗效的生物标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于预测FMT治疗SLE疗效的生物标志物，所述生物标志物位于人类基因组2号染色体162,318,336

【技术实现步骤摘要】
用于预测FMT治疗SLE疗效的生物标志物及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于预测FMT治疗SLE疗效的生物标志物及其应用。

技术介绍

[0002]系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多器官、多系统受累的自身免疫性疾病。临床表现为肾脏、神经精神系统、血液系统等多器官受损，严重影响患者身心健康。目前治疗SLE主要依赖糖皮质激素、免疫抑制剂等药物，但上述药物存在消化道反应、骨质疏松及感染等副作用，并有部分患者对药物治疗不应答，因此SLE亟待安全、高效的治疗新方法。
[0003]人体肠道微生物已经对人体代谢、免疫及炎症反应具有重要的调控作用。越来越多的研究表明，SLE患者肠道中存在明显的菌群失衡，SLE患者肠道菌群α多样性，呈现出已布劳特氏菌属为驱动的不同于健康人的新肠型，伴随拟杆菌属与粪杆菌属的显著降低。粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)是将健康人粪便中的肠道群通过鼻饲管、胶囊等方式移植到患者肠道内，重建肠道菌群，从而达到治疗疾病的效果。近年来，FMT已被广泛应用于炎症性肠病、难治性便秘等疾病的治疗中。2021年课题组于中南大学湘雅二医院开展单臂临床试验，初步验证FMT治疗活动性SLE的有效性及安全性。结果表明SLE患者对FMT治疗应答率为42.12％，首次证实FMT在活动性SLE患者中是一种安全、可行、潜在有效的临床治疗新选择，可显著降低患者SLEDAI2K评分、尿蛋白/尿肌酐比值及血清抗dsDNA抗体水平。同时FMT可能通过改变肠道微生物组成及其代谢功能，使其从促炎肠道菌群表型转变为抗炎表型，降低外周血IL6浓度及CD4+memory/比值，从而改善SLE活动性。
[0004]鉴于仍有部分SLE患者对FMT治疗不应答，因此，提供一种特异性好、灵敏度高的生物标志物用于早期预测FMT治疗疗效反应从而实现精准治疗具有重要意义。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种用于预测FMT治疗SLE疗效的生物标志物。
[0006]本申请提供了一种高灵敏高特异的SLE患者外周血DNA甲基化生物标志物，用于预测FMT治疗疗效并指导精准治疗，并相应提供一种用于预测FMT治疗疗效的检测方法。
[0007]具体地，所述生物标志物是人IFIH1基因转录起始位点上游1500个bp内一段DNA序列，即位于人类基因组2号染色体162,318,336
‑
162,318,718段(人类基因组数据hg19版本)，其DNA序列如SEQ ID No.1所示：
[0008][0009]其中，斜线黑体为对应的两个CG位点。
[0010]在此基础上，本专利技术提出了上述生物标志物在制备用于预测FMT治疗SLE疗效的试剂或试剂盒中的应用。
[0011]具体地，通过测定受试者外周血细胞中如SEQ ID No.1所定义的DNA序列中包含的两个CG位点的甲基化水平来指示FMT治疗是否有效，其中，两个CG位点中任一个或两个的甲基化水平的升高指示FMT治疗有效。
[0012]在一个具体的实施方式中，通过如下方法测定两个CG位点的甲基化水平：
[0013](1)抽提受试者外周血全基因组DNA；
[0014](2)测定抽提出基因组DNA浓度；
[0015](3)亚硫酸盐处理外周血基因组DNA；
[0016](4)特异性PCR引物扩增目的DNA序列；
[0017](5)电泳检测DNA产物后进行DNA测序；
[0018](6)分析测序结果，得到两个特定CG位点的甲基化水平。
[0019]具体检测过程中使用的试剂可以根据公知技术进行选择。
[0020]其中，步骤(4)中，所述的特异性PCT扩增引物为：
[0021]上游引物：5'
‑
AGAATTGTTTGATAGAAAGTTGGATTTAA
‑
3'(SEQ ID No.2)；
[0022]下游引物：5'
‑
AATACCCATTCCACATCTTTCTTTCTCA
‑
3'(SEQ ID No.3)。
[0023]同时，为了检测两个CG位点的甲基化水平，还设计了用于焦磷酸测序所需的特应性测序探针，探针序列为：5'
‑
GTTTTTATTAGAGTGTGTAGTAGG
‑
3'(SEQ ID No.4).
[0024]本专利技术进一步提出了一种预测FMT治疗SLE疗效的试剂盒，包含其包含用于扩增权SEQ ID No.1所示的生物标志物的引物，其中，所述引物序列为：
[0025]上游引物：5'
‑
AGAATTGTTTGATAGAAAGTTGGATTTAA
‑
3'(SEQ ID No.2)；
[0026]下游引物：5'
‑
AATACCCATTCCACATCTTTCTTTCTCA
‑
3'(SEQ ID No.3)；
[0027]所述下游引物的5
’
端用生物素biotin标记。
[0028]所示试剂盒还包括一条用于焦磷酸测序所需的特应性测序探针，探针序列为：5'
‑
GTTTTTATTAGAGTGTGTAGTAGG
‑
3'(SEQ ID No.4)。
[0029]有益效果：专利技术人经过长期研究发现，SLE患者基因组异常的表观遗传学修饰，特别是DNA甲基化对SLE发生发展起到重要作用。通过对FMT治疗前后的SLE患者外周血细胞中IFIH1基因转录起始位点上2000bp内的序列进行DNA甲基化测序，证实其包含的2个CG位点的甲基化水平在治疗有效组中，治疗后(第四周)较治疗前基线水平显著上升，而在无效组
中无明显变化。且在基线水平，有效组甲基化水平显著高于无效组，这两个CG位点用于预测FMT治疗SLE是否有效的灵敏度和特异性均很高。
附图说明
[0030]图1为使用特异性引物PCR扩增目的DNA片段SEQ ID No.1的电泳结果图；
[0031]图2为CG位点1的甲基化在FMT治疗有效组患者治疗前(基线期)水平及治疗后(第4周、12周)水平的差异；
[0032]图3为CG位点2的甲基化在FMT治疗有效组患者治疗前(基线期)水平及治疗后(第4周、12周)水平的差异；
[0033]图4为CG位点1的甲基化在FMT治疗无效组患者治疗前(基线期)水平及治疗后(第4周、12周)水平的差异；
[0034]图5为CG位点2的甲基化在FMT治疗无效组患者治疗前(基线期)水平及治疗后(第4周)水平的差异；
[0035]图6为为CG位点1的甲基化在治疗前(基线期)FMT治疗有效组患者和无效组患者水平的差异；
[0036本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于预测FMT治疗SLE疗效的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物位于人类基因组2号染色体162,318,336
‑
162,318,718段（人类基因组数据hg19版本），其序列如SEQ ID No.1所示。2.权利要求1所述的生物标志物在制备用于预测FMT治疗SLE疗效的试剂或试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过测定受试者外周血细胞中如SEQ ID No.1所定义的DNA序列中包含的两个CG位点的甲基化水平来指示FMT治疗是否有效，其中，两个CG位点中任一个或两个的甲基化水平的升高指示FMT治疗有效。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过如下步骤测定两个CG位点的甲基化水平：（1）抽提受试者外周血全基因组DNA；（2）测定抽提出基因组DNA浓度；（3）亚硫酸盐处理外周血基因组DNA；（4）特异性PCR引物扩增目的DNA序列；（5）电泳检测DNA产物后进行DNA测序；（6）分析测序结果，得到两个特定CG位点的甲基化水平。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，所述的特异性PCT扩增引物为：上游引物：5'
‑
AGAATTGTTTGATAGAAAGTTGGATTTAA
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【专利技术属性】
技术研发人员：陆前进，赵明，张博，周雯慧，
申请(专利权)人：中国医学科学院皮肤病医院中国医学科学院皮肤病研究所，
类型：发明
国别省市：