一种用于实验室评估吸入纳米聚苯乙烯塑料肺毒性的方法技术

本发明专利技术提供了一种实验室长期吸入纳米塑料产生肺毒性的评价方法。本发明专利技术通过体内、外实验多角度地对暴露于粒径分别为20、50、100、200和500 nm的5种不同粒径的聚苯乙烯纳米塑料后，肺泡巨噬细胞的细胞毒性指标、氧化应激指标以及小鼠肺部炎症指标进行了毒理学评价。本发明专利技术为长期吸入纳米塑料的毒理学研究提供了一种较为全面且成本低廉、操作简单易行的评价方法，有利于开展纳米塑料对健康风险评估。有利于开展纳米塑料对健康风险评估。有利于开展纳米塑料对健康风险评估。

【技术实现步骤摘要】
一种用于实验室评估吸入纳米聚苯乙烯塑料肺毒性的方法


[0001]本专利技术涉及生物技术与环境毒理学评价领域。具体涉及一种实验室评估吸入纳米聚苯乙烯塑料肺毒性的方法。

技术介绍

[0002]塑料的专利技术彻底地改变了我们的生活方式，塑料制品也在我们的日常生活中广泛应用。由于经济和社会因素，全球塑料回收率仍然很低，因此塑料的广泛使用在世界范围内带来了严重的环境污染问题。在自然环境中，大块塑料污染物易发生老化和分解，进而产生大量微塑料。微塑料进一步分解形成纳米塑料(粒径在1～1000nm之间的塑料颗粒)，因其体积小、比表面积大、生物穿透性强，极易被生物体摄取，长期积累导致对生物的机体功能产生严重影响。纳米塑料引起的环境污染和生态毒性已引起各界的广泛关注。
[0003]事实证明，大气中漂浮着大量的纳米塑料，且成分复杂，来源广泛。例如，塑料制品的降解和破碎、垃圾焚烧、工业和交通排放等过程中均会释放大量纳米塑料颗粒，他们在风力作用下与水蒸气、粉尘、纤维等形成气溶胶分散在大气环境中。因此，在正常大气条件下，人类极有可能会吸入纳米塑料颗粒。而且肺泡表面积约为150m2，与外界大气直接接触的毛细血管非常丰富，纳米颗粒极易穿过肺泡表面的组织屏障进一步渗透到血液循环系统中。有研究发现，纳米聚苯乙烯颗粒和红细胞通过范德华力、静电力、氢键和疏水作用等相互吸附和渗透，这些过程大大促进纳米塑料颗粒在体内的易位和积累，避免被肝脏和脾脏清除。在体内蓄积的纳米颗粒可能通过氧化应激作用损伤细胞，产生活性氧并进一步影响器官的正常功能。
[0004]然而，关于通过呼吸摄入纳米聚苯乙烯塑料颗粒的毒性研究，尤其是应用于哺乳动物的毒性研究仍然有限，并且存在研究方法片面、分析方法复杂等不足，难以全面地、系统地评估通过呼吸摄入纳米塑料对哺乳动物甚至人类可能带来的健康隐患。因此，目前迫切需要提供一种能够多角度、多层次评估纳米塑料吸入风险的评估方法，这对人类健康风险相关研究的发展十分重要。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种系统的，简单易行的，并且针对哺乳动物模型的纳米塑料毒理学评价方法以解决现有的技术问题。提供了一种非治疗目的的纳米聚苯乙烯塑料的肺毒性评估方法，该方法包括体外评估和体内评估两方面，用于纳米塑料对哺乳动物健康危害和生态危险的评估领域，可以为纳米塑料毒性的生态危险性以及对人类健康风险提供有效的评估手段。
[0006]本专利技术主要通过以下技术方案实现：
[0007]一种用于实验室评估吸入纳米聚苯乙烯塑料肺毒性的方法，该方法包括以下步骤：
[0008](1)将细胞暴露在不同浓度、不同粒径的纳米聚苯乙烯悬浮液中培养一定时长，以
正常培养的细胞作为对照组，检测并计算受试组与对照组的细胞存活率。
[0009](2)将细胞暴露在一定的纳米聚苯乙烯悬浮液中培养，以正常培养的细胞作为对照组，检测细胞凋亡情况。
[0010](3)将细胞暴露在一定的纳米聚苯乙烯悬浮液中培养，以正常培养的细胞作为对照组，检测细胞内氧化还原微环境的指标变化。
[0011](4)5
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6周龄雄性BALB/C小鼠，适应性饲养7天后，每天固定时间，通过气道内滴注恒定浓度的聚苯乙烯悬浮液将小鼠暴露在纳米聚苯乙烯塑料共十次。
[0012](5)检测小鼠肺泡灌洗液中的炎性细胞浸润情况。
[0013](6)检测小鼠肺部组织病变情况。
[0014]进一步地，步骤(1)所述纳米聚苯乙烯按水合粒径不同，尺寸在20～500nm之间，优选地，选择20nm,50nm,100nm,200nm,500nm五种粒径的聚苯乙烯塑料球。
[0015]优选地，步骤(1)所述纳米聚苯乙烯颗粒悬浮液浓度梯度为0
‑
500μg/mL。
[0016]优选地，所述细胞为小鼠肺泡巨噬细胞系——MH
‑
S细胞；细胞活力检测方法为MTT比色法。
[0017]所述以正常培养的细胞作为对照组是指以不含纳米聚苯乙烯的培养基培养的细胞。
[0018]进一步地，步骤(2)所述的纳米聚苯乙烯颗粒悬浮液终浓度为20μg/mL，暴露时间为4小时。
[0019]骤2和步骤3所用的纳米颗粒的浓度依据步骤(1)中MTT毒性试验数据进行选取。
[0020]优选地，使用Annexin V/PI双标记法检测细胞凋亡情况。
[0021]进一步地，步骤(3)所述的氧化还原指标主要为细胞内活性氧(ROS)以及还原型谷胱甘肽(GSH)含量，纳米聚苯乙烯浓度为20μg/mL，暴露时间为4小时。
[0022]进一步地，步骤(4)所述的实验动物按照空白对照组3只，阴性对照组、受试组(20nm，50nm，100nm，200nm，500nm)每组各5只随机分组。优选地，小鼠体重为18
‑
20g。
[0023]优选地，染毒方式为改进的无创伤的气道滴注染毒法，相比于以往的开放气道染毒，此染毒法有效地减少了局部感染的发生，极大提升了小鼠的存活率，为连续染毒提供了支持。染毒浓度为统一的3mg/kg.体重，每隔两天染毒一次，共10次。
[0024]进一步地，步骤(5)所述的炎性细胞优选为炎性单核细胞(流式细胞术中表面标记物CD45/CD11b/Ly6C阳性的细胞群)和中性粒细胞(流式细胞术中表面标记物CD45/CD11b/Ly6G阳性的细胞群)
[0025]进一步地，步骤(5)所述的组织病理学切片样本优选自左肺上叶肺尖处，取样品重量约0.1g。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0027]与现有技术相比，本专利技术采取无创的气道内滴注的注射方式来模拟人类通过口鼻吸入纳米塑料的过程，实验中在保证注射药物全部注射入动物体内的同时最大程度的减少了实验动物的创伤，实现了重复染毒来评估长期吸入纳米聚苯乙烯的毒性作用。
[0028]本专利技术以纳米聚苯乙烯的粒径作为变量，研究粒径大小与毒性作用之间的联系，实验具有针对性。
[0029]本专利技术通过体外细胞水平和体内动物水平来全面评估纳米聚苯乙烯的毒性风险，
实验方法可以多维度的分析纳米聚苯乙烯的毒性机制。实验数据具有说服力，能够客观真实地反应纳米塑料可能带来的健康风险。
[0030]整个实验过程中不涉及复杂实验操作或昂贵实验材料，操作简便，重复性较好。
[0031]综上所述，本专利技术具有操作简便、染毒方式安全可靠、实验针对性强、多层次评价等诸多优点，能够为纳米毒理学研究提供很好的实验方法，有望成为重要的吸入式纳米聚苯乙烯毒性评估方法。
附图说明
[0032]图1为不同尺寸的纳米聚苯乙烯塑料颗粒的透射电子显微镜图。
[0033]图2为不同粒径纳米聚苯乙烯对MH
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S细胞存活率的影响统计直方图。
[0034]图3为流式细胞术Annexin V/PI双标记法检测细胞凋亡情况统计直方图。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于实验室评估吸入纳米聚苯乙烯塑料肺毒性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）将肺泡巨噬细胞暴露在不同浓度、不同粒径的纳米聚苯乙烯悬浮液中培养，检测细胞存活率；（2）将肺泡巨噬细胞暴露在纳米聚苯乙烯悬浮液中培养，检测细胞凋亡情况；（3）将肺泡巨噬细胞暴露在纳米聚苯乙烯悬浮液中培养，检测细胞内氧化还原微环境的指标变化；（4）5
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6周龄雄性BALB/C小鼠，适应性饲养7天后，每天固定时间，通过气道内滴注恒定浓度的聚苯乙烯悬浮液将小鼠暴露在纳米聚苯乙烯塑料共十次；（5）检测小鼠肺泡灌洗液中的炎性细胞浸润情况；（6）检测小鼠肺部组织病变情况。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中：所述纳米聚苯乙烯的尺寸在20~500 nm之间；所述纳米聚苯乙烯颗粒悬浮液浓度梯度为0
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500 μg/mL；采用MTT比色法检测细胞存活率。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的纳米聚苯乙烯悬浮液的浓度为20 μg/mL，暴露时间为4小时，使...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵堃，孙薪博，李广哲，黄佳豪，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：