用于敲除OATP1B基因的sgRNA及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于敲除OATP1B基因的sgRNA及其应用，属于基因工程技术领域。所述sgRNA包含与Cas酶结合的骨架结构域和与靶点结合的靶向结构域，所述OATP1B基因包括OATP1B3基因和OATP1B1基因，靶向敲除OATP1B3基因的sgRNA的靶向结构域选自如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
用于敲除OATP1B基因的sgRNA及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种用于敲除OATP1B基因的sgRNA及其应用。

技术介绍

[0002]药
‑
药相互作用风险的评估核心是相关药物代谢酶和药物转运体的抑制与诱导的评判，并聚焦于包括兼有两者属性的总平衡考察，而在药物暴露水平上对于药物转运体的诱导与抑制潜能的影响在临床上越来越显示出其重要性。然而，目前对药物转运体的专属性筛选还不完备，常规方法是将转运体基因植入细胞内进行高表达，考察药物在转基因型与野生型的差异性，但由于基因植入位置的随机性以及细胞内原有转运体的干扰等因素，使其专一转运体净贡献评估欠准确。
[0003]CRISPR/Cas9技术的原理为，以crRNA(CRISPR
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derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans
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activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白再与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single
‑
guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9 nuclease
‑
null)融合，并表达适当的sgRNA，可以靶向定位任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。据此，基于CRSIPR
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Cas9技术能定点敲除特定的细胞内原有转运体基因，这样，敲除型结合野生型对比实验，将专一性地反映该被敲除基因的转运体的净贡献。
[0004]有机阴离子转运多肽(OATPs)属于溶质运载体(solute carrier，SLC)超家族，能介导药物及内源性物质的跨膜转运。其中OATP1B3在肝脏中的表达较高，它位于肝细胞的基底侧，在药物的肝摄取过程中起到至关重要的作用。它底物众多，很多在结构上不相关的药物均会经由其转运，其中包括临床上常用药物，如羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂(他汀类)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(沙坦类)、血管紧张肽转换酶抑制剂和抗糖尿病类药物(列奈类)等。对于这些药物，肝摄取转运体OATP1B3介导转运活性的抑制会改变其血药浓度，继而产生严重的不良反应。有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)是另一种负责转运多种内外源性物质进入肝细胞发挥作用的摄入型转运蛋白。OATP1B1转运底物范围广，有可能会竞争性地抑制OATP1B1介导的胆红素转运，继而引发胆红素代谢异常等疾病。OATP1B1/OATP1B3转运体抑制后的表现相似。在治疗肿瘤过程中，抗体药物、抗体偶联药物(Antibody
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drug conjugates,ADC)、双抗药物等药物的使用，以及嵌合抗原受体T细胞/B细胞/NK细胞免疫疗法(CAR
‑
T/B/NK)等免疫治疗所降解的一些蛋白肽片段会经由OATP转运，会升高在临床上产生药
‑
药相互作用(Drug
‑
Drug Interaction，DDI)的风险。
[0005]因此，研究药物与肝摄取转运体OATP1B3和OATP1B1相关性对于药物相互作用评价
具有重要意义。但是，目前尚无针对OATP1B3或OATP1B1转运体基因敲除的细胞模型，因此利用CRSIPR
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Cas9开发可应用于对药物转运体的专属性筛选的细胞模型具有一定的科学意义及应用前景。

技术实现思路

[0006]基于此，有必要针对上述问题，提供一种用于敲除OATP1B基因的sgRNA，通过该sgRNA的作用，可定点敲除内源性转运体OATP基因所得到的细胞系，与野生型细胞系作药
‑
药相互作用试验时，能够专一性强地反映OATP对药物的净贡献，促进完善药
‑
药相互作用的风险评估体系。
[0007]一种用于敲除OATP1B基因的sgRNA，所述sgRNA包含与Cas酶结合的骨架结构域和与靶点结合的靶向结构域，所述OATP1B基因包括OATP1B3基因和OATP1B1基因，靶向敲除OATP1B3基因的sgRNA包含如SEQ ID NO.1
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2所示序列，靶向敲除OATP1B1基因的sgRNA包含如SEQ ID NO.7
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9所示序列。
[0008]专利技术人在前期调研中发现，有机阴离子转运多肽(OATP，Organic anion transporting polypeptide)家族的成员广泛分布于人体各器官中，介导药物跨细胞膜的转运。其中OATP1B1和OATP1B3特异性表达于肝细胞基底外侧膜，对于通过肝脏吸收与代谢的药物的药动学和药效学都起着重要的作用。
[0009]OATP1B1在肝细胞的正弦膜上高度表达，又被称为肝特异性转运体
‑
1(691个氨基酸)，主要发挥摄取转运的作用，可以介导多种有机化合物的跨膜转运，包括胆汁酸(胆酸盐和牛磺胆酸盐)，共类固醇(雌二醇
‑
17
‑
葡糖醛酸，雌酮
‑3‑
硫酸盐和脱表雄酮
‑3‑
硫酸盐)，类花生酸(白三烯C4和E4.前列腺素E2和血栓烷B2)，甲状腺素和三碘甲状腺素等。除了内源性和外源性化合物外，OATPIB1还可以介导许多药物的转运，包括HGM
‑
CoA还原酶抑制剂，血管紧张素酶抑制剂和血管紧张素I受体阻断剂等。因此，OATP1B1是重要的药物转运蛋白，与P
‑
糖蛋白和多药耐药蛋白(MRPs)一起发挥着重要作用。并在整体药物吸收和药物处置中也起到了重要作用，例如，该转运蛋白的结构功能包括：1)在TM1中发现了两个显著影响OATP1B1转运功能的赖氨酸及在TM6中鉴定了两个高度保守的色氨酸，与OATP1B1和底物的结合、底物的选择性等相关；对TM11的研究则发现了7个关键氨基酸，它们在蛋白稳定性、膜定位以及底物结合等方面影响OATP1B1的转运能力；2)研究发现蛋白激酶C(PKC)的激活会影响OATP1B1在细胞膜上的表达，从而改变其转运底物的能力。该过程是通过PKC促进转运蛋白的内化和外循环导致的；3)OATP1B1可形成同源二聚体及更高阶的寡聚体，并发现该同源寡聚体的正确形成与模式底物硫酸雌酮的转运相关。
[0010]OATP1B3是具有702个氨基酸的糖蛋白，并与OATP1B1有80％氨基酸相似性，主要分布在肝脏的静脉血管周围。OATP1B3与OATP1B1相似，可调节本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于敲除OATP1B基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包含与Cas酶结合的骨架结构域和与靶点结合的靶向结构域，所述OATP1B基因包括OATP1B3基因和OATP1B1基因，靶向敲除OATP1B3基因的sgRNA包含如SEQ ID NO.1
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2所示序列，靶向敲除OATP1B1基因的sgRNA包含如SEQ ID NO.7
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9所示序列，所述sgRNA用于敲除HepaRG细胞中的OATP1B基因。2.权利要求1所述的sgRNA在构建OATP1B3和/或OATP1B1基因敲除型HepaRG细胞模型中的应用。3.一种构建OATP1B基因敲除型细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建表达载体：分别构建表达Cas9蛋白酶的pCas9表达质粒和表达所述sgRNA的pU6
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sgRNA重组敲除载体表达质粒；转染：将重组敲除载体表达质粒和pCas9表达质粒转入受体细胞HepaRG中；细胞单克隆培养：培养、筛选稳定且已敲除OATP1B1或OATP1B3基因的细胞株，即得。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述构建表达载体步骤中，按照以下方法进行：将权利要求1所述的sgRNA进行退火反应，并将所得的退火产物连接至U6
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sgRNA质粒载体，获得重组敲除载体。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞单克隆培养步骤中，培养OATP1B1敲除细胞株的培养基为：含有体积百分浓度为2％DMSO和10μM Forskolin的HepaRG培养基；培养OATP1B3敲除细胞株的培养基为：含有体积百分浓度为2％DMSO、50μM Forskolin和25μM SB431542的HepaRG培养基。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞单克隆培养步骤中，用G418对转染细胞进行筛选，并通过基因型测序鉴定，得到目标细胞。...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴仁科，陈雨阳，郭子钲，江伟凡，
申请(专利权)人：广东睿谷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：