一种用于前列腺癌的慢病毒及其制备方法和应用技术

本申请涉及一种用于前列腺癌的慢病毒及其制备方法和应用，其中慢病毒的RNAi靶点序列选自GAAGAAGCAGGAGGCTAAGAA、CTCCTGCGATTAACCAGTTCA、CAAAGCAAGAGAAGAAGCAGA中的任意一种，本申请人在上海自然基金支持下(项目编号19ZR1454800)通过上述靶点序列构筑了oligo DNA双链序列和包含上述oligo DNA双链序列的慢病毒载体质粒并最终形成慢病毒，慢病毒中带有的抗性基因可有效降低目的基因RPL7A的mRNA表达量，对前列腺癌细胞的细胞增殖和细胞迁移具有较高的抑制效率，本发明专利技术制备的慢病毒可用于治疗前列腺癌的药物中。于治疗前列腺癌的药物中。

【技术实现步骤摘要】
一种用于前列腺癌的慢病毒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于前列腺癌的慢病毒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]前列腺癌是在男性中发病率和死亡率均很高的恶性肿瘤之一，对男性健康造成了严重威胁。我国近十几年来，前列腺癌的发病率逐年上升；虽然对前列腺癌的早期诊断水平和治疗措施已经得到了很大提高，但晚期前列腺癌患者愈后仍然会有复发的危险，因此对前列腺癌的治疗一直是医疗工作者的研究焦点。Homo sapiens ribosomal protein L7a(RPL7A，NCBI Reference Sequence：NM
‑
000972.3)属于核糖体蛋白质L7AE家族，该基因可与trk原癌基因重排，形成嵌合癌基因trk
‑
2h；目前，该基因被证实对前列腺癌细胞的发展也密切相关；确定前列腺癌的特异性基因，明确其表达状态，并针对该基因研制和开发药物制剂，有效的提高前列腺癌的治疗效率，减少药物的毒副作用，具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0003]为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种用于前列腺癌的慢病毒。针对目的基因序列，根据RNAi序列设计原则，确定了一种慢病毒的RNAi靶点序列。
[0004]所述慢病毒的RNAi靶点序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3中的任一种，其中：
[0005]SEQ ID NO.1的片段编码序列为：GAAGAAGCAGGAGGCTAAGAA；
[0006]SEQ ID NO.2的片段编码序列为：CTCCTGCGATTAACCAGTTCA；
[0007]SEQ ID NO.3的片段编码序列为：CAAAGCAAGAGAAGAAGCAGA。
[0008]在一种优选的实施方式中，所述慢病毒的RNAi靶点序列选自SEQ ID NO.1。
[0009]进一步地，本申请将上述靶点序列构建到相应的慢病毒载体上，提供了一种慢病毒载体质粒；其制备步骤包括：
[0010](1)选择工具载体，获取目的基因片段；
[0011](2)合成单链引物和oligo DNA；
[0012](3)将oligo DNA和线性化的工具载体连接后转化；
[0013](4)菌落PCR鉴定、测序、质粒抽提；
[0014]所述步骤(1)中，选择BR
‑
V108作为工具载体，所述目的基因片段的核心序列为GAAGAAGCAGGAGGCTAAGAA。
[0015]所述步骤(2)中，单链引物包含以下序列：
[0016]5’‑
ccggCAAAGCAAGAGAAGAAGCAGActcgagTCTGCTTCTTCTCTTGCT TTGtttttg
‑3’
和
[0017]5’‑
aattcaaaaaCAAAGCAAGAGAAGAAGCAGActcgagTCTGCTTCTTCTCTTGCT TTG
‑3’
。
[0018]所述引物退火形成oligo DNA，所述oligo DNA包含以下序列：
[0019]上游链：
[0020]5’‑
ccggCAAAGCAAGAGAAGAAGCAGActcgagTCTGCTTCTTCTCTTGCTTTGt ttttg
‑3’
；
[0021]下游链：
[0022]5’‑
aattcaaaaaCAAAGCAAGAGAAGAAGCAGActcgagTCTGCTTCTTCTCTTGCT TTG
‑3’
。
[0023]所述制备步骤(3)中需对工具载体进行酶切，酶切位点为EcoR I和Age I，将酶切后的工具载体与oligo DNA在反应体系中反应1
‑
3h后，将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中进行转化。
[0024]所述菌落PCR鉴定中，鉴定引物
‑
F序列为
[0025]CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA，鉴定引物
‑
R序列为
[0026]GTAATACGGTTATCCACGCG。
[0027]其次，本专利技术提供了一种所述慢病毒的制备方法，所述的慢病毒由上述慢病毒载体质粒、psPAX2载体质粒和pMD2G载体质粒三质粒共转染293T细胞制成。
[0028]所述慢病毒的制备步骤包括：(1)转染前12
‑
18h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，用含10％FBS的培养基调整细胞密度约(4.5
‑
6)
×
106/15mL，重新接种于10cm细胞培养皿中，在培养箱内培养。待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；
[0029](2)转染前2h时细胞培养基更换为无血清培养基；
[0030](3)在Opti
‑
MEM R1培养基中加入各DNA 溶液，室温静置；在另一Opti
‑
MEM R1培养基中加入对应质量的懿贝瑞转染试剂DYB3893，室温静置；将两者轻柔混匀并在室温下静置；
[0031](4)混合液滴加至293T细胞培养液中，放置细胞培养箱中培养；
[0032](5)收集转染后48h、72h的细胞上清液。
[0033]所述DNA溶液中慢病毒载体质粒8
‑
12μg、pMD2.G载体质粒6
‑
9μg、pSPAX2载体质粒3
‑
7μg。
[0034]所述慢病毒载体系统的宿主细胞可选择为PC
‑
3、22RV1、DU 145、C4
‑
2、LN cap中的一种或几种。
[0035]所述慢病毒可用于抑制前列腺癌细胞的增殖过程，在治疗前列腺癌的药物中使用。
[0036]有益效果
[0037]本专利技术针对前列腺癌提供了一种慢病毒，针对目的基因设计了合适的RNAi靶点序列和oligo DNA双链序列，并构建了包含上述oligo DNA双链序列的慢病毒载体质粒和最终形成的慢病毒；慢病毒中带有的抗性基因可有效降低目的基因RPL7A的mRNA表达量，敲减作用非常明显，对前列腺癌细胞的细胞增殖和细胞迁移具有较高的抑制效率，可用于治疗前列腺癌的药物中，并且本专利技术可高通量操作、可重复性高。
附图说明
[0038]图1为real
‑
time qPCR方法检测基因RPL7A在不同细胞中的本底表达结果；
[0039]图2为real
‑
time qPCR方法检测基因RPL7A在感染实施例1
‑
3的慢病毒的DU 145细胞中的表达水平；
[0040]图3为real
‑
time qPCR方法检测基因RPL7A在感染实施例1的慢病毒的LNcap细胞中的表达水平；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于前列腺癌的慢病毒，其特征在于，慢病毒的RNAi靶点序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3中的任一种；其中：SEQ ID NO.1的片段编码序列为：GAAGAAGCAGGAGGCTAAGAA；SEQ ID NO.2的片段编码序列为：CTCCTGCGATTAACCAGTTCA；SEQ ID NO.3的片段编码序列为：CAAAGCAAGAGAAGAAGCAGA。2.根据权利要求1所述的慢病毒，其特征在于，慢病毒载体质粒的制备步骤包括：(1)选择工具载体，获取目的基因片段；(2)合成单链引物和oligo DNA；(3)将oligo DNA和线性化的载体连接后转化；(4)菌落PCR鉴定、测序、质粒抽提；所述菌落PCR鉴定中，鉴定引物
‑
F序列为CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA，鉴定引物
‑
R序列为GTAATACGGTTATCCACGCG。3.根据权利要求2所述的慢病毒，其特征在于，选择BR
‑
V108作为工具载体。4.根据权利要求3所述的慢病毒，其特征在于，所述单链引物包含以下序列：5
’‑
ccggCAAAGCAAGAGAAGAAGCAGActcgagTCTGCTTCTTCTCTTGCTTTGt ttttg
‑3’
和5
’‑
aattcaaaaaCAAAGCAAGAGAAGAAGCAGActcgagTCTGCTTCTTCTCTTGCT TTG
‑3’
。5.根据权利要求4所述的慢病毒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王飞飞，
申请(专利权)人：权利要求书一页说明书九页序列表电子公布附图二页，
类型：发明
国别省市：