一种产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种产D

【技术实现步骤摘要】
一种产D
‑
泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种产D
‑
泛酸基因工程菌及构建方法，及其在微生物发酵制备D
‑
泛酸中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]泛酸，也称为维生素B5，是辅酶A的组成成分之一，在能量代谢以及柠檬酸循环等重要生化反应中起到关键作用。因此，作为一种重要的维生素及前体物质，D
‑
泛酸在饲料、医药以及化妆品等方面得到广泛应用。在已知的D
‑
泛酸合成方法中，生物发酵法生产D
‑
泛酸具有底物廉价、易分离、毒性小等优势而受到关注。但目前利用生物法生产D
‑
泛酸仍存在缺陷，例如发酵过程不稳定、产量不高等问题。因此，构建一株更高产的D
‑
泛酸菌株仍是一大挑战。
(三)
技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是运用理性设计和CRISPR
‑
Cas9基因编辑技术，提供一种高产D
‑
泛酸的基因工程菌构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D
‑
泛酸中的应用。
[0004]本专利技术采用的技术方案是：
[0005]一种产D
‑
泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
[0006](1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌，在其基因组上增加受启动子pTrc调控的EcilvD基因拷贝数，得到工程菌DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc
‑
EcilvD，记为工程菌DPAP7；
[0007](2)在工程菌DPAP7基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌BspanBA基因拷贝数，得到工程菌DPAP7 derivative，flik::Ptrc
‑
BspanBA，记为工程菌DPAP8；
[0008](3)在工程菌DPAP8基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的谷氨酸棒杆菌CgpanC基因拷贝数，得到工程菌DPAP8 derivative，ompT::Ptrc
‑
CgpanC，记为工程菌DPAP9；
[0009](4)在工程菌DPAP9基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌alsS基因拷贝数，得到工程菌DPAP9 derivative，yjiP::Ptrc
‑
alsS，记为工程菌DPAP10；
[0010](5)在工程菌DPAP10基因组上通过基因敲入方式进一步增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌BspanBB基因拷贝数，得到工程菌DPAP10derivative，ydeU::Ptrc
‑
BspanBB，记为工程菌DPAP11；BspanBB与BspanBA相比仅仅是启动子与rbs位点间隔变小，BspanB的序列是相同的；
[0011](6)将工程菌DPAP11基因组中nac基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP11 derivative，nac
GTG
，记为工程菌DPAP12；
[0012](7)敲除工程菌DPAP12基因组中ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5，得
到工程菌DPAP12 derivative，ΔP
345ptsH
，记为工程菌DPAP13；
[0013](8)将工程菌DPAP13基因组中gltA基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP13 derivative，gltA
GTG
，记为工程菌DPAP14；
[0014](9)将工程菌DPAP14基因组中gltA基因起始密码子GTG替换为TTG，得到工程菌DPAP14 derivative，gltA
TTG
，记为工程菌DPAP15；
[0015](10)将工程菌DPAP15基因组中pfkB基因原位启动子替换为Ptrc，得到工程菌DPAP15 derivative，PpfkB::Ptrc，记为工程菌DPAP16，即所述产D
‑
泛酸的基因工程菌。
[0016]本专利技术在底盘菌ZJUTDPAL5(E.coli W3110，Trc
‑
panCpanEpanBilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*/ΔilvA/Trc
‑
lpd/Δglk/ilvA*/Trc
‑
pck/Trc
‑
maeB/Trc
‑
ilvBN/gdhA*
T
，已在CN113637618A中公开)的基础上，综合运用系统代谢工程策略，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过基因敲入引入异源基因，增强大肠杆菌生物体内泛解酸合成途径中关键基因表达水平，进一步使碳通量流向D
‑
泛酸的合成。为继续增强碳通量流向D
‑
泛酸的合成，通过削弱氮限制负调控转录因子，激活糖酵解前端基因拉动碳流，节约磷酸烯醇式丙酮酸及减少中心碳流进入TCA，最终得到一株无质粒、无抗生素添加用于产D
‑
泛酸的工程菌株。
[0017]所述受Ptrc启动子调控的EcilvD、BspanBA、CgpanC、BspanBB、alsS基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～5所示，所述nac
GTG
核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示，所述gltA
GTG
核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述gltA
TTG
核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述pfkB基因原位启动子核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示。
[0018]本专利技术还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
[0019](1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌，运用CRISPR
‑
Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的EcilvD基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiV，增强EcilvD的表达强度，得到工程菌DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc
‑
EcilvD，记为工程菌DPAP7；
[0020](2)以工程菌DPAP7为出发菌株，运用CRISPR
‑
Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的BspanBA基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因flik，增强BspanBA的表达强度，得到工程菌DPAP7 derivative，flik::Ptrc
‑
BspanBA，记为工程菌DPAP8；
[0021](3)以工程菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产D
‑
泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：(1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌，在其基因组上增加受启动子pTrc调控的EcilvD基因拷贝数，得到工程菌DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc
‑
EcilvD，记为工程菌DPAP7；(2)在工程菌DPAP7基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌BspanBA基因拷贝数，得到工程菌DPAP7 derivative，flik::Ptrc
‑
BspanBA，记为工程菌DPAP8；(3)在工程菌DPAP8基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的谷氨酸棒杆菌CgpanC基因拷贝数，得到工程菌DPAP8 derivative，ompT::Ptrc
‑
CgpanC，记为工程菌DPAP9；(4)在工程菌DPAP9基因组上通过基因敲入方式增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌alsS基因拷贝数，得到工程菌DPAP9 derivative，yjiP::Ptrc
‑
alsS，记为工程菌DPAP10；(5)在工程菌DPAP10基因组上通过基因敲入方式进一步增加受启动子pTrc调控的枯草芽孢杆菌BspanBB基因拷贝数，得到工程菌DPAP10derivative，ydeU::Ptrc
‑
BspanBB，记为工程菌DPAP11；(6)将工程菌DPAP11基因组中nac基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP11 derivative，nac
GTG
，记为工程菌DPAP12；(7)敲除工程菌DPAP12基因组中ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5，得到工程菌DPAP12 derivative，ΔP
345ptsH
，记为工程菌DPAP13；(8)将工程菌DPAP13基因组中gltA基因起始密码子ATG替换为GTG，得到工程菌DPAP13 derivative，gltA
GTG
，记为工程菌DPAP14；(9)将工程菌DPAP14基因组中gltA基因起始密码子GTG替换为TTG，得到工程菌DPAP14 derivative，gltA
TTG
，记为工程菌DPAP15；(10)将工程菌DPAP15基因组中pfkB基因原位启动子替换为Ptrc，得到工程菌DPAP15 derivative，PpfkB::Ptrc，记为工程菌DPAP16，即所述产D
‑
泛酸的基因工程菌。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述受Ptrc启动子调控的EcilvD、BspanBA、CgpanC、BspanBB、alsS基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～5所示，所述nac
GTG
核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述ptsH、ptsI、crr基因簇前原位启动子P3、P4、P5核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述gltA
GTG
核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述gltA
TTG
核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述pfkB基因原位启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。3.构建权利要求1或2所述基因工程菌的方法，所述方法包括：(1)以基因工程菌ZJUTDPAL5为底盘菌，运用CRISPR
‑
Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的EcilvD基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiV，增强EcilvD的表达强度，得到工程菌DPAL6 derivative，yjiV::Ptrc
‑
EcilvD，记为工程菌DPAP7；(2)以工程菌DPAP7为出发菌株，运用CRISPR
‑
Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的BspanBA基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因flik，增强BspanBA的表达强度，得到工程菌DPAP7 derivative，flik::Ptrc
‑
BspanBA，记为工程菌DPAP8；(3)以工程菌DPAP8为出发菌株，运用CRISPR
‑
Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于
pTrc99A的Ptrc启动子调控的CgpanC基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因ompT，增强CgpanC的表达强度，得到工程菌DPAP8 derivative，ompT::Ptrc
‑
CgpanC，记为工程菌DPAP9；(4)以工程菌DPAP9为出发菌株，运用CRISPR
‑
Cas9介导的基因编辑技术，将受来源于pTrc99A的Ptrc启动子调控的alsS基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiP，增强alsS的表达强度，得到工程菌DPAP9 derivative，yjiP::Ptrc
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：张博，贺周霖，柳志强，唐蒙娜，肖云颖，沈盼，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：