耐中性环境的海因酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种海因酶突变体SEQ ID NO:3，其在pH6.5

【技术实现步骤摘要】
耐中性环境的海因酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物催化
，具体地说，涉及一种海因酶突变体及其在制备N
‑
氨甲酰
‑
D
‑
对羟基苯甘氨酸和D
‑
对羟基苯甘氨酸中的应用。

技术介绍

[0002]D
‑
对羟基苯甘氨酸(D
‑
p
‑
hydroxyphenylglycine，简写D
‑
HPG)又称左旋对羟基苯甘氨酸，分子式为C8H9NO3，结构式如下：
[0003][0004]D
‑
HPG是合成β
‑
内酰胺类半合成广谱抗生素，如阿莫西林、头孢羟氨苄、羟氨苄唑头孢的重要中间体。这类抗生素具有优异的生理功能，诸如抗菌谱广泛，不良作用低，过敏性低，口服效果好，作用时间长等优点。此外，D
‑
HPG也是一些抗菌和抗病毒药物、人工甜味剂的中间体。
[0005]D
‑
HPG的合成方法包括化学合成法和生物酶法。化学法可分为苯甲醛法、β
‑
环糊精法、对羟基苯海因法、活泼酰胺基化合物反应法与乙醛酸法等(D,L
‑
对羟基苯甘氨酸的合成研究.应用化工,2003,32(05):46
‑
49)。但是化学合成法具有反应收率低、能耗高、消旋体手性拆分剂价格高等缺点，不符合当下绿色制造的理念。生物酶法是以D,L
‑
对羟基苯海因为原料，D/>‑
海因酶和氨甲酰水解酶发挥拆分和水解的催化作用生成D
‑
HPG，具有反应步骤少、催化效率高和环境友好等优点，近年来备受关注(Production of D
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p
‑
Hydroxyphenylglycine by N
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Carbamoyl
‑
D
‑
aminoAcid Amidohydrolase
‑
Overproducing Escherichia coli Strains.Biotechnol Prog,1999,15(4):603
‑
607.王亚盟,班睿,刘露,申雨.异源D
‑
海因酶和N
‑
氨甲酰水解酶共表达重组枯草芽孢杆菌的构建.微生物学报,2017,57(1):54
‑
65.)。
[0006]D
‑
海因酶能选择性地将D
‑
对羟基苯海因水解为N
‑
氨甲酰
‑
D
‑
对羟基苯甘氨酸(NC
‑
D
‑
HPG)，残留的L
‑
对羟基苯海因在中性或碱性条件下会迅速自发地消旋为D,L
‑
对羟基苯海因，NC
‑
D
‑
HPG在氨甲酰水解酶的作用下生成D
‑
HPG。
[0007][0008]生物酶法可分为双菌/双酶法和一菌双酶法，在专利文献CN103993010A、
CN110396484A、CN110699396A、CN111621452A、CN112080532A中都有报道。对羟基苯海因在碱性条件下不稳定，会发生自发消旋，因此在酶反应时需要通氮气隔离空气(双酶法合成D
‑
对羟基苯甘氨酸.中国药科大学学报,2001,32(2):155
‑
158)。并且氨甲酰水解酶(DCase)在中性条件下活力高，但在碱性条件下氨甲酰水解酶受到副产物NH4
+
的抑制导致活性降低(Biotechnol Prog,1999,15(4):603
‑
607)。而海因酶(DHase)在较高pH值(pH值8～9)的稳定性较好，但是在pH值低于8.0时酶失活较快。这两种酶对于不同酸碱度的适应性相互矛盾，为了从原料对羟基苯海因出发制备D
‑
对羟基苯甘氨酸，提高底物的酶转化效率，CN112080532A提供了一种级联酶反应，以D,L
‑
对羟基苯海因为底物，首先加入海因酶，在无氧环境中于pH为9.5～11反应得到中间反应液；将中间反应液进行超滤除杂，然后将N
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氨甲酰水解酶加入超滤透过液中，在无氧环境中于pH为7.0～8.5反应至结束，得到D
‑
对羟基苯甘氨酸。该级联反应的缺点也很明显，首先每步反应后都需要进行繁琐的后处理，二是两种酶的酶活力和投料量需要进行实验匹配，必然导致成本上升。综合来看，采用两种酶共表达的一菌双酶法是更理想的选择。

技术实现思路

[0009]为了优化一菌双酶法由对羟基苯海因合成D
‑
对羟基苯甘氨酸的工艺路线，平衡海因酶和氨甲酰水解酶的酸碱度适应性的矛盾，专利技术人对于改变海因酶的pH偏好性进行了探索，通过大范围筛选和突变技术，终于获得了一些耐受中性反应环境的海因酶突变体。进一步地，在专利技术人已经获得的高酶活力的氨甲酰水解酶(CN202310044861.9)基础上，将海因酶突变体与氨甲酰水解酶(SEQ ID NO:5)在大肠杆菌中进行共表达，实现了中性pH值条件下D
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对羟基苯甘氨酸的细胞催化合成。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。
[0010]本专利技术的第一个方面提供了一种海因酶突变体，其为野生海因酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生下述五个以上、优选六个以上位点突变所形成的突变体：Q25L、D45T、D45A、T69A、H124N、L310P、G354R、L394I、P399S，该海因酶突变体具有在pH7.5以下环境中催化D
‑
对羟基苯海因(即D
‑5‑
(4
‑
羟苯基)乙内酰脲)水解为N
‑
氨甲酰
‑
D
‑
对羟基苯甘氨酸(NC
‑
D
‑
HPG)的功能。
[0011]优选地，上述的海因酶突变体为野生海因酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生下述五个以上、优选六个以上位点突变所形成的突变体：Q25L、D45T、T69A、H124N、L310P、G354R、L394I、P399S。
[0012]MMTKLIKNGTIVTATDIYEADLLIQDGKIAVIGRNLDESGAEVIDATGCYVFPGGIDPHTHLDMPFGGTVTKDDFESGTIAAAFGGTTTIIDFCLTNKGEPLKKAIETWHNKATGKAVIDYGFHLMISEITDDVLEELPKVIEEEGITSFKVFMAYKDVFQADDGTLYRTLVAAKELGALVMVHAENGDVIDYLTKKALEDGHTDPIYHALTRPPELEGEATGRACQLTELAGSQLYVVHVSCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海因酶突变体，其特征在于，其为野生海因酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生下述五个以上位点突变所形成的突变体：Q25L、D45T、D45A、T69A、H124N、L310P、G354R、L394I、P399S，该海因酶突变体具有在pH7.5以下环境中催化D
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对羟基苯海因水解为N
‑
氨甲酰
‑
D
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对羟基苯甘氨酸的功能。2.如权利要求1所述的海因酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，是野生海因酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中发生下述六个位点突变所形成的突变体：Q25L、D45T、H124N、G354R、L394I、P399S。3.编码如权利要求1或2所述海因酶突变体的基因。4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，编码海因酶突变体氨基酸序列SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。5.如权利要求1或2所述的海因酶突变体在制备N
‑
氨甲酰
‑
D

【专利技术属性】
技术研发人员：王金刚，韦炎龙，梁岩，任亮，
申请(专利权)人：上海邦林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：