一种制备R-四氢罂粟碱的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备R

【技术实现步骤摘要】
一种制备R
‑
四氢罂粟碱的方法


[0001]本专利技术涉及生物化工
，特别涉及一种高纯度R
‑
四氢罂粟碱的合成方法。

技术介绍

[0002]苯磺顺阿曲库铵是苯磺酸阿曲库铵的全顺式异构体，药效和苯磺酸阿曲库铵相比具有很大的优势，包括无明显组胺释放，肌松作用小，无蓄积作用，且心血管的反应小，对肝、肾等脏器功能的依赖也小，是较为理想的中时效非去极化肌肉松弛剂。
[0003]苯磺酸阿曲库铵于1976年首次被发现，1982年应用于外科手术中。合成工艺主要以四氢罂粟碱和1,5
‑
戊二醇丙烯酸双脂为原料，经过Micheal加成、甲基化反应，最后通过乙醚沉淀得到苯磺酸阿曲库铵。苯磺顺阿曲库铵的合成工艺是在苯磺酸阿曲库铵的合成基础上进行手性拆分制备的。
[0004]苯磺顺阿曲库铵目前合成方法都是以外消旋体四氢罂粟碱为原料，经拆分和碱化游离得R型异构体。
[0005]1992年，Derek等首次提出苯磺顺阿曲库铵的合成方法，以外消旋体四氢罂粟碱为原料与拆分剂N
‑
乙酰
‑
L
‑
亮氨酸反应成盐，经过3次重结晶，得到R
‑
四氢罂粟碱
‑
N
‑
乙酰
‑
L
‑
亮氨酸盐，碱化后得到R
‑
四氢罂粟碱；R
‑
四氢罂粟碱与1,5
‑
戊二醇丙烯酸双酯进行Micheal加成反应，再与苯磺酸甲酯经过氮甲基化反应得苯磺酸阿曲库铵；经柱层析法洗脱，得到溶于水的油状物，冷冻干燥法干燥，得到苯磺顺阿曲库铵。(HILL D A.Neuromuscular blocking agents:America,5453510[P].1995
‑
09
‑
02.)
[0006][0007]1,5
‑
戊二醇丙烯酸双脂价格较贵，合成难度较大，操作条件苛刻，后处理困难。专利CN 200910068233中，宋洪海等将R
‑
四氢罂粟碱与丙烯酸甲酯进行Mi chea l加成反应得到产物R
‑3‑
[1
‑
(3,4
‑
二甲氧基苄基)
‑
6,7
‑
二甲氧基
‑
1,2,3,4
‑
四氢异喹啉]‑
丙烯酸甲酯，
产物与1,5
‑
戊二醇进行酯交换反应，所得中间体与苯磺酸甲酯进行氮甲基化反应，生成苯磺酸阿曲库铵，经柱层析得最终产物。避免了使用1,5
‑
戊二醇丙烯酸双脂，条件温和，成本较低。(CN 200910068233)
[0008][0009]柱层析过程中苯磺顺阿曲库铵稳定性较差，容易分解生成副产物，影响产量。因此将R
‑
四氢罂粟碱与丙烯酸或丙烯酸衍生物进行Mi chea l加成反应，生成化合物Ⅰ，再与苯磺酸甲酯进行氢解反应得到化合物Ⅱ，通过结晶得到R型的化合物Ⅱ，化合物Ⅱ与1,5
‑
戊二醇发生酯化反应，生成中间体Ⅲ，再与R型的Ⅱ酯化缩合生成苯磺顺阿曲库铵，避免生成副产物，降低了反应的难度。(US 20100168431A1)
[0010][0011]虽然众多研究者均进行了工艺改进，但目前的工艺均存在总收率较低的问题，这导致药品成本降不下来，选择高效简洁的合成路线是降低成本的关键。在今后的研究中，四
氢罂粟碱的拆分和苯磺顺阿曲库铵的分离和纯化仍是研究热点。在关键中间体R
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四氢罂粟碱的合成中改用酶法还原路线可以大幅提高总反应收率，为此，我们提出一种制备R
‑
四氢罂粟碱的方法。

技术实现思路

[0012](一)解决的技术问题
[0013]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种利用固定化高选择性、高活性的亚胺还原酶，催化高浓度二氢罂粟碱生成R
‑
四氢罂粟碱。在高底物浓度(5％)条件下，转化率大于90％；ee值大于98.5％。
[0014](二)技术方案
[0015]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
[0016]一种制备R
‑
四氢罂粟碱的方法，用具有亚胺还原酶活性的酶还原二氢罂粟碱(或其盐)，制备R
‑
四氢罂粟碱(或其盐)
[0017][0018]该合成方法包括：
[0019]步骤一：将含有高(R)选择性亚胺还原酶以及葡萄糖脱氢酶的基因，植入菌株，并将菌株进行平板培养，挑选单克隆进行逐级培养；
[0020]步骤二：将亚胺还原酶粗酶液和葡萄糖脱氢酶粗酶液加入到活化好的环氧树脂载体，通过震荡交联，得到固定化混合酶；
[0021]步骤三：通过固定化混合酶催化二氢罂粟碱生成R
‑
四氢罂粟碱。
[0022]优选的，所述步骤一中，菌株培养包括以下步骤：
[0023]首先，转入3ml含50μM卡那霉素的LB培养液中过夜培养，接种量1％转接到100ml含50μM卡那霉素的LB培养液中，培养4～8h；
[0024]然后，转入10L发酵罐里进行培养；当细胞OD达25左右，降温至30℃，加入0.5mM异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷(I PTG)，继续培养18小时诱导目的蛋白表达。
[0025]优选的，所述菌株培养后，取发酵液高速离心收集细胞获得湿菌体600～1000g，
‑
20℃保存待用。
[0026]优选的，所述高速离心以6000rpm旋转30mi n，且LB培养液的温度保持在37℃，并以220rpm的转速搅拌。
[0027]优选的，所述步骤二中，环氧树脂载体的制备包括以下步骤：
[0028]10g环氧载体加入40mL 100mM PBS缓冲液，在温度20
‑
25℃，转速150rpm，搅拌或振荡15min，抽滤，用50mMPBS缓冲液水洗两遍，抽干即得活化的环氧树脂固定化载体；
[0029]其中，PBS缓冲液的pH＝8.0。
[0030]优选的，所述步骤二中，亚胺还原酶粗酶液和葡萄糖脱氢酶粗酶液均采用同一制
备方法制备，且该制备包括以下步骤：
[0031]取10g亚胺还原酶或者葡萄糖脱氢酶表达的细胞重悬于100mlPBS缓冲液混合均匀，利用高压均质破碎细胞，离心13000rpm 60min，上清经0.4μm膜过滤，获得酶液；
[0032]其中，PBS缓冲液选用50mM，pH＝8.0。
[0033]优选的，所述步骤二中，震荡交联包括以下步骤：
[0034](1)、在25℃温度下，以180rpm转速振荡交联20h，抽滤水洗三次；
[0035](2)、用pH＝8本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备R
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四氢罂粟碱的方法，其特征在于：用具有亚胺还原酶活性的酶还原二氢罂粟碱(或其盐)，制备R
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四氢罂粟碱(或其盐)2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反应中添加辅酶NADH或NADPH再生体系。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述亚胺还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述辅酶再生体系包含选自以下的酶：葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖宇，卞雨花，王关兴，杨建花，裴本陆，顾志锋，王勇，李可来，喻红忠，
申请(专利权)人：上海昱菘医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：