针叶树胚胎发生组织的连续培养制造技术

本发明专利技术提供针叶树胚胎发生组织的增殖方法。本发明专利技术方法分别包括在液体增殖培养基中连续培养针叶树胚胎发生组织的时间段足以使胚胎发生组织增殖的步骤。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外生产植物胚胎，以及任选从植物胚胎中生产植物的方法。
技术介绍
以针叶树(例如，松树和枞树)制造木材制品的需求不断增长。建议针对此问题的一个解决方案是识别单个树木，其具有理想特征，诸如生长快速，并且通过体细胞克隆生产众多遗传上相同的质优树木的无性系。体细胞克隆是从没有合子的植物细胞中体外生产植物胚胎的方法。这些克隆可被培育成具有理想特征的一片针叶树或整个林子。用于体细胞克隆针叶树的一个方法是，在促进处理的组织形成针叶树体细胞胚，然后是全植株的条件下，体外处理分离的活的针叶树组织。分离的针叶树组织可在一种或多种auxin和/或细胞分裂素存在下培养，以促进形成和增殖胚胎发生组织，接着在促进形成子叶针叶树胚胎的条件被培养。然后，胚胎发芽生成针叶树。针叶树胚胎发生组织的例子为通过体外组织培养可从切自针叶树种籽的胚胎中形成的胚胎囊柄团(embryonal suspensor masses)(ESMs)。以示例方式，附图说明图1示出液体培养物中的松树胚胎囊柄团。图2示出形成白ESM的子叶松树体细胞胚(子叶在胚胎的圆顶是可见的)。然而，一直困扰的问题是刺激有效形成能够以高效发芽生成针叶树植株的子叶针叶树体细胞胚。优选地，在针叶树同样物种的种籽中，体外形成的子叶针叶树体细胞胚在形态学，解剖学和生化学上相似或相同于体内形成的合子针叶树胚胎。具体而言，需要比现有技术方法生产的量更大的合子样子叶针叶树体细胞胚的体外生产方法。优选地，由新方法生产的子叶针叶树体细胞胚的发芽率和质量应高于现有技术方法。专利技术概述如上所述，本专利技术提供了体外增殖针叶树胚胎组织的方法。本专利技术方法分别包括在液体增殖培养基中连续培养针叶树胚胎发生组织足够长的时间段使胚胎发生组织增殖的步骤。本专利技术方法在例如，体外增殖针叶树胚胎发生组织中是有用的。增殖的胚胎发生组织可进一步培养以生产可发芽和长成针叶树树木的针叶树子叶体细胞胚。因此，本专利技术方法利于生产具有所需属性(例如，生长率增加)的针叶树树木，从而有助于满足木材和木材制品的需求。附图简述本专利技术的前述方面和伴随的许多优点参照下列详述并结合附图将变得更容易理解，其中图1示出液体培养物中的松树胚胎囊柄团；以及图2示出形成自ESM的子叶松树体细胞胚(子叶在胚胎圆顶是可见的)。优选实施方案详述如本专利技术所用的术语“子叶胚胎”表示具有一个或多个子叶的胚胎。如本专利技术所用的术语“体细胞胚”是指自不是合子的植物细胞体外发育的植物胚胎。如本专利技术所用的术语“胚胎发生组织”是指任何衍生自针叶树的组织，在用本专利技术方法处理后能够生产一个或多个子叶针叶树体细胞胚。因此，术语“胚胎发生组织”包括例如，针叶树胚胎囊柄团。如本专利技术所用的术语“增殖培养基”是指液体培养基，其可促进针叶树胚胎发生组织在增殖培养基中培养时的增殖。如本专利技术所用的术语“连续培养”及其意思上的等同物适用于针叶树胚胎发生组织的培养，表示在液体增殖培养基中通过周期性(至少一次)向培养物中添加额外的增殖培养基而无需移出原始增殖培养基来培养针叶树胚胎发生组织。因此，例如，针叶树胚胎发生组织可培养在体积为50mL的增殖培养基中一周，然后向原始体积的增殖培养基中另加入体积为50mL的增殖培养基，从而胚胎发生组织进一步培养在100mL的增殖培养基中。在连续培养针叶树胚胎发生组织的实践中，为了评价培养参数(例如，生长率和组织质量)，需取出少量培养组织。除非另有所指，所有浓度值以重量/体积百分比表示。本专利技术提供用于体外增殖针叶树胚胎发生组织的方法。本专利技术方法分别包括在液体增殖培养基中连续培养针叶树胚胎发生组织足够长的时间段以使胚胎发生组织增殖的步骤。本专利技术方法可用于增殖从任何针叶树物种获得的针叶树胚胎发生组织，所述针叶树物种诸如松科树的成员，包括Pinus属的成员(例如，火炬松(Pinus taeda))，或诸如Pseudotsuga属的成员(例如，花旗松(Pseudotsuga menziesii))。本专利技术的连续培养方法是对现有技术所教导的“分批”培养方法的改进。在分批培养方法中，针叶树胚胎发生组织在液体增殖培养基中培养一段时间，从增殖培养基分离出胚胎发生组织(例如，让胚胎发生组织从培养基中沉降出来)，接着胚胎发生组织的等份试样取出并转入分开体积的新鲜增殖培养基中用于进一步培养。每当需要生成多重容器时，就重复此方法，所述容器各自包括分开批次的胚胎发生组织培养物。采用连续培养比分批培养具有若干优点例如，在分批培养中胚胎发生组织必须周期性地传代培养至新的生长容器中，而连续培养通常只需相对较少的劳力；以及胚胎发生组织在连续培养中一般比在分批培养方法的批次之间发生的培养变异性较少。在实施本专利技术中有用的胚胎发生组织的例子为胚胎囊柄团(ESMs)。ESMs可从针叶树种籽中取出的前子叶胚胎制备。种籽通常被表面灭菌后，再取出前子叶胚胎，然后在起始培养基之上或之中培养，所述培养基允许形成ESMs，其包括在通过发芽和分裂而增殖的过程中的早期胚胎。如果需要，培养基可包括刺激早期胚胎增殖的激素。培养基中所含激素的例子有auxins(例如，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))和细胞分裂素(例如，6-苄氨基嘌呤(BAP))。Auxins可用的浓度例如从1mg/L到200mg/L。细胞分裂素可用的浓度例如从0.1mg/L到50mg/L。对培养火炬松前子叶胚胎以诱导形成ESMs有用的培养基的例子为本专利技术实施例2中所述的LM1培养基。对培养花旗松前子叶胚胎以诱导形成ESMs有用的培养基的例子为本专利技术实施例3中所述的DM1培养基。增殖培养基的配制促进针叶树胚胎发生组织，诸如胚胎囊柄团的生长和增殖。增殖培养基可被搅拌以促进胚胎发生组织的生长和增殖。增殖培养基的同渗重摩一般为180-400mM/kg。增殖培养基含有的营养物维持胚胎发生组织，并且包括促进胚胎发生组织的细胞分裂和生长的激素，诸如一种或多种auxins和/或细胞分裂素。在增殖培养基中，一般需要，虽不是必要的，包括麦芽糖作为唯一或主要的可代谢糖源。有用麦芽糖浓度的例子范围为约2.5％至约6.0％。合适的火炬松液体增殖培养基的例子为入本专利技术实施例2所述的LM2培养基(无胶凝剂)。合适的花旗松增殖培养基的例子为入本专利技术实施例3所述的DM2培养基。针叶树胚胎发生组织通常培养在增殖培养基中(例如，多达6个月的时间段)，周期性(例如，每周一次)加入更多的增殖培养基，培养的合适温度诸如从10-30℃，或诸如从15-25℃，或诸如从20-23℃。在本专利技术方法的有些实施方案中，针叶树胚胎组织的体积与周期性加入到胚胎发生组织的连续培养物中的新鲜增殖培养基的体积之比为约1∶2到约1∶5；在本专利技术方法的有些实施方案中，针叶树胚胎组织的体积与周期性加入到胚胎发生组织的连续培养物中的新鲜增殖培养基的体积之比为约1∶3到约1∶5；以及在本专利技术方法的有些实施方案中，针叶树胚胎组织的体积与周期性加入到胚胎发生组织的连续培养物中的新鲜增殖培养基的体积之比为约1∶4到约1∶5。上下文中所用的术语“约”包括比率的确切范围(例如，范围“约1∶4到约1∶5”包括范围1∶4到1∶5)。针叶树胚胎发生组织的体积的测量可将培养容器在室温(通常为20-25℃)下置于水平面(例如，实验台)上30分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增殖针叶树胚胎发生组织的方法，所述方法包括在液体增殖培养基中连续培养针叶树胚胎发生组织足够的时间段以使胚胎发生组织增殖的步骤。

【技术特征摘要】
US 2004-2-25 60/547,4751.一种增殖针叶树胚胎发生组织的方法，所述方法包括在液体增殖培养基中连续培养针叶树胚胎发生组织足够的时间段以使胚胎发生组织增殖的步骤。2.权利要求1的方法，其中胚胎发生组织几乎由胚胎囊柄团组成。3.权利要求1的方法，其中胚胎组织为火炬松胚胎发生组织。4.权利要求1的方法，其中胚胎组织为花旗松胚胎发生组织。5.权利要求1的方法，其中将针叶树胚胎发生组织培养在第一体积的增殖培养基中，以及连续培养通过周期性向第一体积的增殖培养基中加入新鲜液体增殖培养而实现。6.权利要求5的方法，其中新鲜增殖培养基每周一次加入到培养的胚胎发生组织中。7.权利要求6的方法，其中新鲜增殖培养基每周一次加入到培养的胚胎发生组织，历时2周到...

【专利技术属性】
技术研发人员：普拉莫德古普塔，黛安娜G霍尔姆斯特伦，博尼拉森，
申请(专利权)人：韦尔豪泽公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]