一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术构建能稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P12A和3B3C蛋白酶的重组腺病毒rAdv

【技术实现步骤摘要】
一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]口蹄疫(Foot
‑
and
‑
mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot
‑
and
‑
mouth disease virus，FMDV)引起的一种以在口腔粘膜、四肢下端及乳房皮肤形成水疱或烂斑，幼年动物多因心肌受损而死亡率较高为主要特征的急性、高度接触性传染病。
[0003]目前，主要利用疫苗接种和扑杀手段来控制FMD的传播。预防该病的主要方法是FMD灭活疫苗的免疫接种，但只能提供短期保护作用，对七种血清型具有血清型特异性，而且存在FMDV不完全灭活和病毒逃逸的潜在风险，使得新型疫苗的研究成为FMD研究的重点。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒及其构建方法，为FMD疫苗的研制提供良好的免疫原。
[0005]本专利技术提供了一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒，以腺病毒为基础毒株，重组表达FMDV灭活疫苗毒株衣壳蛋白前体P12A和3B3C。
[0006]优选的，所述口蹄疫病毒灭活疫苗毒株包括O型FMDV灭活疫苗毒株或A型FMDV灭活疫苗毒株。
[0007]优选的，所述O型FMDV灭活疫苗毒株包括OZK93和/或OA58；
>[0008]所述A型FMDV灭活疫苗毒株包括FMDV灭活疫苗毒株AF72。
[0009]优选的，OZK93来源的P12A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0010]OZK93来源的3B3C的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0011]AF72来源的P12A的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0012]AF72来源的3B3C的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0013]OA58来源的P12A的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0014]OA58来源的3B3C的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0015]本专利技术提供了所述重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
[0016]1)分别扩增编码衣壳蛋白前体P12A和3B3C的序列，连接后，得到的P12A3B3C片段插入腺病毒穿梭载体中，得到重组腺病毒穿梭载体；
[0017]2)将步骤1)中得到的所述重组腺病毒穿梭载体联合腺病毒骨架质粒进行包装，得到重组腺病毒。
[0018]优选的，扩增编码OZK93来源的衣壳蛋白前体P12A核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示的反向引物；
[0019]扩增编码OZK93来源的衣壳蛋白前体3B3C核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如
SEQ ID NO:9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的反向引物；
[0020]扩增编码AF72来源的衣壳蛋白前体P12A核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的反向引物；
[0021]扩增编码AF72来源的衣壳蛋白前体3B3C核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的反向引物；
[0022]扩增编码OA58来源的衣壳蛋白前体P12A核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的反向引物；
[0023]扩增编码OA58来源的衣壳蛋白前体3B3C核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示的反向引物。
[0024]本专利技术提供了一种防控口蹄疫的疫苗，包括佐剂和所述重组腺病毒或所述构建方法得到的重组腺病毒。
[0025]优选的，所述重组腺病毒包括重组腺病毒rAdv
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P12A3B3C
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OZK93、rAdv
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P12A3B3C
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OA58和rAdv
‑
P12A3B3C
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AF72中的一种或几种。
[0026]优选的，所述rAdv
‑
P12A3B3C
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OZK93和rAdv
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P12A3B3C
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AF72的滴度比为(5～7)：(3～8)。
[0027]本专利技术提供了所述重组腺病毒或所述构建方法得到的重组腺病毒在制备防控口蹄疫疫苗中的应用。
[0028]本专利技术提供了一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒，以腺病毒为基础毒株，重组表达FMDV灭活疫苗毒株衣壳蛋白前体P12A和3B3C。其中P12A基因表达的是构成口蹄疫衣壳的四种结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1，3C蛋白是切割P12A的主要蛋白酶，3B有利于进一步增强3C剪切力。用P12A3B3C作为免疫抗原构建的重组腺病毒，表现出良好的免疫原性，免疫动物后，产生高滴度抗FMDV抗体和细胞免疫应答。
[0029]同时，本专利技术提供的重组腺病毒，免疫动物后，能够针对不同血清型FMDV产生大量抗体，因此，重组腺病毒制备成疫苗后对FMDV防控具有良好的普适性。
附图说明
[0030]图1为FMDV重组腺病毒构建示意图；
[0031]图2为PCR获得FMDV
‑
OZK93的P12A和3B3C片段；M：5000DNA分子质量标准；1:3B3C片段；2：P12A片段；
[0032]图3为PCR获得FMDV
‑
OZK93的P12A3B3C片段；M：5000DNA分子质量标准；1:P12A3B3C片段；2：阴性对照；
[0033]图4为FMDV
‑
OZK93
‑
P12A3B3C双酶切；M：5000DNA分子质量标准；1:FMDV
‑
OZK93
‑
P12A3B3C片段；
[0034]图5pDC316
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mCMV
‑
EGFP载体双酶切；M：10000DNA分子质量标准；1
‑
3:pDC316
‑
mCMV
‑
EGFP质粒；
[0035]图6为重组载体pDC316
‑
mCMV
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EGFP
‑
P12A3B3C
‑
OZK93双酶切鉴定；M1：10000DNA分子质量标准；1
‑
7:pDC316
‑
mCMV<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒，其特征在于，以腺病毒为基础毒株，重组表达FMDV灭活疫苗毒株衣壳蛋白前体P12A和3B3C。2.根据权利要求1所述重组腺病毒，其特征在于，所述口蹄疫病毒灭活疫苗毒株包括O型FMDV灭活疫苗毒株或A型FMDV灭活疫苗毒株。3.根据权利要求2所述重组腺病毒，其特征在于，所述O型FMDV灭活疫苗毒株包括OZK93和/或OA58；所述A型FMDV灭活疫苗毒株包括FMDV灭活疫苗毒株AF72。4.根据权利要求3所述重组腺病毒，其特征在于，OZK93来源的P12A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；OZK93来源的3B3C的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；AF72来源的P12A的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；AF72来源的3B3C的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；OA58来源的P12A的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；OA58来源的3B3C的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。5.权利要求1～4任意一项所述重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分别扩增编码衣壳蛋白前体P12A和3B3C的序列，连接后，得到的P12A3B3C片段插入腺病毒穿梭载体中，得到重组腺病毒穿梭载体；2)将步骤1)中得到的所述重组腺病毒穿梭载体联合腺病毒骨架质粒进行包装，得到重组腺病毒。6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，扩增编码OZK93来源的衣壳蛋白前体P12A核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物；扩增编码OZK93来源的衣壳蛋白前体3B3C核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的反向引物；扩增编码AF72来源的衣壳蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘新生，王灿灿，张莉萍，于瑞明，潘丽，周鹏，张中旺，吕建亮，王永录，张永光，郭慧琛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：