一种强化菌种发酵五碳糖制备丁醇的方法技术

本发明专利技术涉及一种强化菌种发酵五碳糖制备丁醇的方法。本发明专利技术的目的在于提高菌种对木糖的耐受力，强化菌种利用五碳糖发酵丁醇的能力和效率。本发明专利技术以五碳糖溶液为培养基筛选产丁醇菌株，以农作物秸秆酸水解液与玉米粉水溶液按照不同比例配制的混合溶液作为产五碳糖菌株驯化培养基，驯化后的菌株结合诱变处理，获得高效利用五碳糖发酵丁醇的菌种。采用本发明专利技术提供的方法，可以强化丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、巴氏梭菌等产丁醇菌种利用五碳糖的性能，为充分利用农作物秸秆五碳糖进行丁醇生物发酵提供了一种有效的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于丙酮丁醇生物发酵
，特别涉及一种强化菌种发酵五碳糖制备 丁醇的方法。
技术介绍
丙酮、丁醇是重要的有机试剂和化工原料，在化工、能源以及食品等工业中有着广 泛用途。传统的发酵法生产丙酮、丁醇是以玉米为淀粉质或糖蜜等为原料发酵生产，其工艺 复杂，成本高，致使化学合成法逐渐取代了发酵法。现在随着石油资源的日趋减少和环境问 题的不断恶化，利用可再生资源微生物发酵生产丙酮丁醇引起了世界各国的普遍关注。以 玉米类粮食为原料发酵丙酮丁醇，不仅生产成本高，而且也违背了粮食安全战略，因此，以 可再生资源为原料，开发新型的丙酮丁醇发酵工艺具有重要意义。秸秆是价格低廉，来源 广泛的可再生资源。其酶解产物中包含葡萄糖、木糖和半乳糖等多种糖类，都能够被丙酮 丁醇梭菌利用发酵。以秸秆为原料进行丙酮丁醇发酵的研究已经有很多，如Ropars等利 用汽爆玉米芯酶解液制取丙酮丁醇(Ropars，et al，Bioresource Technology, 1992,42 197-204)，陈守文等利用稻草酶解液制取丙酮丁醇(陈守文等，工业微生物，1998，28 (4) 30-34)。目前，常用的丙酮丁醇生产菌主要有丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)和 拜氏梭菌(C. beijerinckii)。C. acetobutylicum是在稳定生长期开始产丁醇，而 C.beijerinckii则在快速生长期开始产丁醇。在这两种菌的基础上，各国的研究者采用了 多种方法来强化和获得高活性发酵菌株，提高产物中丁醇比例。通过诱变或基因改造以得 到溶剂高产的菌株的研究报道较多，专利技术专利ZL 95111733.5 “高丁醇比丙酮丁醇梭菌及 其培养方法与应用”提供一种丙酮丁醇梭菌突变菌株EA 2018，具有发酵生产溶剂中丁醇比 高达67 72%的特性，专利技术专利200810239560. 7 “重组丙酮丁醇梭菌及其构建方法与应 用”利用基因重组方法构建了丙酮丁醇梭菌重组菌，其最高丁醇产率可达到13. 7g/L ；专利技术 专利200610147876. 4“一种生物法生产高丁醇的丙酮丁醇的方法”采用含淀粉物质为原料， 辅以酶法前处理和培养基C/N比优化处理，使丁醇的比例高达78%。但是由于木质纤维原料，尤其是农作物秸秆组成不均一性，使其水解产生的水解 液组成也非常复杂。因此，即使通过以上基因或者诱变方法获得的高丁醇比菌种在产业化 运用时，还是难以实现稳定高效的丁醇生产。另一方面，秸秆水解产物中同时存在着木糖和 葡萄糖等多种糖，现有菌种利用木糖发酵丁醇的能力，与葡萄糖(六碳糖)利用相比，菌株 的木糖利用率低、木糖发酵时间长，在葡萄糖与木糖共存的情况下，菌株总是优先利用葡萄 糖，木糖的利用滞后。因此提高菌种对混合糖(玉米粉和纤维素水解液)的利用率，使菌种 在利用六碳糖的同时尽最大量利用五碳糖并缩短发酵时间。但是，目前还没有见到强化菌 种发酵五碳糖能力的菌种改造等方面的专利技术专利。
技术实现思路
本专利技术的目的本专利技术涉及。本专利技术的 目的一方面在于提高菌种以五碳糖为原料发酵丁醇的耐受力，另一方面在于强化菌种利用 五碳糖发酵丁醇的能力和效率。本专利技术的构思为了利用农作物秸秆发酵丁醇，首先要采用适当的预处理方法使 其产生可供微生物发酵的糖。目前常用的方法有化学稀酸水解法、物理蒸汽爆破法、生物酶 法等，所产生的水解液产物组成复杂，并且可能存在一些影响菌种生长和产物代谢的物质， 即使是通过基因或者诱变方法获得的高丁醇比菌种也难以实现稳定高效的丁醇生产。因 此，必须强化微生物的耐受性。另外，利用农作物秸秆进行丁醇发酵，是五碳糖和葡萄糖的 混合糖发酵过程，菌株总是优先利用葡萄糖，五碳糖的利用滞后，也导致了发酵时间较长。 因此，必须强化菌种发酵五碳糖制备丁醇的能力。基于此，本专利提出了一种强化菌种发酵 五碳糖制备丁醇的方法。本专利技术技术方案本专利技术所述的，其特征在于采用菌种驯 化的方法提高菌株发酵五碳糖的能力。本专利技术所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现1)取甘油管菌种，接种于7%的玉米培养基中，待醪盖全部浮起后转接到一定浓 度的试管木糖培养基中。37°C恒温培养，培养中不断产生气泡。在37°C下培养48-56h，取 少量醪液涂布在固体平板上，平板置于真空干燥器中，抽真空，37°C恒温培养3-4d，平板表 面出现单菌落，并作记号。2)产溶剂菌株的筛选将固体平板培养基上长出的菌落接入一定浓度的试管木 糖培养基中(15X 150mm)，每支试管装料10ml，37 °C恒温培养，待醪液生长至对数期时， 转接入较高浓度的试管木糖培养基(15X 150mm)中，每支试管装料IOml ；37°C恒温培养 48-72h，然后进行色谱分析，比较各菌株的溶剂总量和丙酮、丁醇、乙醇三种成分的相对比 例。经多次发酵筛选，确定最优的产溶剂出发菌株。3)产溶剂菌株的驯化以确定的最优产溶剂出发菌株进行五碳糖发酵性能的驯 化。以秸秆稀酸水解液和玉米粉按照不同比例混合物作为丁醇发酵驯化培养基。随着驯化 的进行逐渐提高秸秆稀酸水解液的浓度，并减少玉米粉的浓度，以强化菌株发酵五碳糖产 丁醇的能力。首先以起始比例的秸秆酸水解液与玉米粉水溶液混合培养基进行驯化，培养条件 同步骤2)，发酵结束后，进行色谱分析，若在此比例下菌株发酵五碳糖产丁醇浓度有所提 高，则梯级提高秸秆酸水解液的浓度，依次按照其与7%玉米粉水溶液比例(ν/ν)为2 1， 3 1，4 1……的比例进行梯度驯化。每驯化一个梯度，反复进行5次驯化。若经过多次 驯化，菌株仍然难以生长且发酵产物中丁醇比无明显提高，则确定上一个梯度作为丁醇发 酵的最终培养基浓度。本专利技术所采用的菌种驯化培养基，其特征在于，是以农作物秸秆酸水解液与7% (w/v)玉米粉水溶液按照不同比例混合而成的，两者的比例为1 1 1 9(v/v)。本专利技术所采用的利用木糖产丁醇的菌种来自丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)、 巴氏芽抱梭菌(C. pasteurianum)、拜氏梭菌(C. bei jerinckii)。经过本专利技术强化菌种可以进一步通过驯化提高发酵五碳糖的性能。本专利技术的优点在于，本专利技术以农作物秸秆酸水解液与玉米粉水溶液的混合溶液 直接进行产五碳糖菌株的驯化，显著强化了微生物对秸秆水解液的耐受性，并提高了菌株 发酵五碳糖的能力，为充分利用农作物秸秆五碳糖进行丁醇生物发酵提供了一种有效的方 法。也有助于降低微生物发酵丁醇的成本。具体实施方式实施例1取甘油管丙酮丁醇梭菌CGMCC 1. 135(C. acetobutylicum)l支，接种于7%的玉米 培养基中，待醪盖全部浮起后转接到6%试管木糖培养基中。37°C恒温培养，培养中不断产 生气泡。37°C培养48h，取少量醪液涂布在固体平板上，平板置于真空干燥器中，抽真空， 37°C恒温培养3-4d，平板表面出现单菌落，将各单菌落进行编号。选取平板上的单菌落，将其接入6%的试管五碳糖(15X150mm)培养基中，每支试管 装料10ml，37°C恒温培养，待醪液生长至对数期时接入6%的试管五碳糖(15X150mm)培养基 中，每支试管装料10ml。37°C恒温培养48h后进行色谱分析，比本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种强化菌种发酵五碳糖制备丁醇的方法，其特征包括以下步骤：１）菌种活化；２）产丁醇菌株的筛选；３）产丁醇菌株的驯化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈洪章，邱卫华，马保华，生晓东，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，香港来禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]