一种磁性适配体探针、其制备方法和应用及迁移体富集方法技术

本发明专利技术提供了一种磁性适配体探针、其制备方法和应用及迁移体富集方法，属于生物医药技术领域，本发明专利技术提供的磁性适配体探针，包括骨架和修饰在骨架表面的适配体Apt_B3，所述骨架为Fe3O4纳米粒子，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该磁性适配体探针能够克服现有技术中未能实现迁移体高效富集的问题。本发明专利技术提供的磁性适配体探针具有优异的特异性，为富集检测方法的准确性提供了保障，在成分复杂的临床血浆样本中的表现依然十分优异，即便有多种杂质干扰，依然显示出良好的特异性，能够比离心法富集到更多的蛋白，还能够富集到一些离心法无法获得的蛋白组分，为生物标志物的寻找带来更多可能。物标志物的寻找带来更多可能。物标志物的寻找带来更多可能。

【技术实现步骤摘要】
一种磁性适配体探针、其制备方法和应用及迁移体富集方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种磁性适配体探针、其制备方法和应用及迁移体富集方法。

技术介绍

[0002]迁移体是细胞定向移动过程中，细胞尾部收缩丝交汇处和尖端部位产生的单层膜囊泡结构。顾名思义，迁移体的形成依赖于细胞的迁移，由于形成机制的差异，迁移体在大小、分子组成和生物学功能等方面也有别于外泌体、微泡等细胞外囊泡。迁移体涉及多种生理和病理过程，能够在肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞与肿瘤微环境之间进行功能性转运，从而影响癌症的发生、发展和转移。现有的研究结果显示，肿瘤来源的迁移体可以释放进入循环系统，其携带内容物能够反映肿瘤细胞特征，具有代替肿瘤细胞本身作为液体活检的生物标志物的潜力。因此，富集和检测迁移体及其内容物对肿瘤的精准诊断、早期治疗和改善预后具有重要意义。
[0003]迁移体的富集主要依靠物理特性（尺寸大小和密度），利用逐渐增大的离心力和梯度蔗糖溶液的密度差异，依次经超速离心法和密度梯度离心法将迁移体与其他EVs成分进行分离。然而，这些方法对样本量需求较大，且存在操作繁琐、耗时长、成本高昂、回收率低且没有标准化等问题。此外，血液中迁移体含量相对较少，且存在大量细胞、蛋白质、无机离子等物质，这些物质在传统离心富集的过程中会与迁移体共同沉淀，影响富集迁移体的纯度和后续检测结果的准确性。因此，迁移体的高效富集仍是目前限制其相关研究和应用的一大问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种磁性适配体探针、其制备方法和应用及迁移体富集方法，以解决现有技术中未能实现迁移体高效富集的问题。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种磁性适配体探针，包括骨架和修饰在骨架表面的适配体Apt_B3，所述骨架为Fe3O4纳米粒子，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]本专利技术还提供了上述磁性适配体探针的制备方法，包括以下步骤：在Fe3O4纳米粒子表面修饰SiO2层、氨基层和中性亲和素蛋白，得到Fe3O4@SiO2‑
NA纳米粒子；在适配体Apt_B3的5
’
端修饰生物素，得到Biotin
‑
Apt_B3，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；将Biotin
‑
Apt_B3粉末与水混合，然后依次进行热处理和低温处理，得到Biotin
‑
Apt_B3水溶液；将Biotin
‑
Apt_B3水溶液和Fe3O4@SiO2‑
NA纳米粒子混合，孵育20~40分钟，得到磁性适配体探针。
[0007]优选的，所述热处理的温度为90~100℃，所述热处理的时间为3~8分钟。
[0008]优选的，所述低温处理的温度为
‑
5~5℃，所述低温处理的时间为5~15分钟。
[0009]优选的，所述Biotin
‑
Apt_B3水溶液的浓度为300~800nM；所述Fe3O4@SiO2‑
NA纳米粒子和Biotin
‑
Apt_B3水溶液混合时，Fe3O4@SiO2‑
NA纳米粒子和Biotin
‑
Apt_B3水溶液的质量体积比为0.5~1.5mg:1mL。
[0010]优选的，所述孵育的温度为2~6℃；所述孵育伴随振荡，所述振荡的转速为800
‑
1200rpm。
[0011]优选的，所述孵育之后还包括将磁性适配体探针进行洗涤；所述洗涤的次数为1~3次。
[0012]本专利技术还提供了上述磁性适配体探针在制备肿瘤诊断试剂盒和/或肿瘤治疗药物中的应用。
[0013]本专利技术还提供了一种迁移体富集方法，包括以下步骤：将样品进行第一次离心，得到第一上清和第一沉淀；将第一上清进行第二次离心，得到第二上清和第二沉淀；将第二上清与上述磁性适配体探针混合，孵育20~40分钟，得到混合液；将混合液进行磁分离，即实现迁移体富集。
[0014]优选的，所述第一次离心的转速为800~1200g；所述第一次离心的时间为5~15分钟；所述第二次离心的转速为3800~4200g；所述第二次离心的时间为15~25分钟；所述第一次离心和第二次离心的温度独立的为2~6℃；所述样品的体积与磁性适配体探针的质量的添加比例为1~30mL:0.05~1mg。
[0015]本专利技术的技术效果和优点：本专利技术提供的磁性适配体探针具有优异的特异性，为富集检测方法的准确性提供了保障，在成分复杂的临床血浆样本中的表现依然十分优异，即便有多种杂质干扰，依然显示出良好的特异性，能够比离心法富集到更多的蛋白，还能够富集到一些离心法无法获得的蛋白组分，为生物标志物的寻找带来更多可能。
[0016]本专利技术提供的迁移体富集方法结合了适配体的特异性以及磁性功能材料的快速磁响应特性，具有快速简便、特异性高、富集成本低、可以批量操作的优点，突破了当前方法学上的瓶颈，为临床样本迁移体的富集提供了新的选择，也为更深入的迁移体检测方法提供了技术支持。相较于现有技术中需要大量实验耗材的离心法或需要昂贵抗体参与的蛋白免疫亲和法而言，本专利技术提供的方法更加节约成本，仅通过短时间孵育就能完成样本中迁移体的高效富集，与长达数小时的离心法相比，具有明显的速度提升，更适合临床应用。
附图说明
[0017]图1为磁性适配体探针对迁移体的捕获原理图；图2为Fe3O4@SiO2‑
NA纳米粒子的粒径分布图；图3为磁性适配体探针的粒径分布图；图4为Fe3O4@SiO2‑
NA纳米粒子和磁性适配体探针的表面电位检测结果图；
图5为激光共聚焦显微镜检测适配体的修饰情况结果图，图中A为Fe3O4@SiO2‑
NH2纳米粒子与5
’
Biotin, 3
’
Fam
‑
Apt_B3孵育后进行检测的结果图，B为Fe3O4@SiO2‑
NA纳米粒子与5
’
Biotin, 3
’
Fam
‑
Apt_B3孵育后进行检测的结果图，激发态波长均为488nm；图6为激光共聚焦显微镜观察L929细胞收缩丝上的迁移体情况图；图7为迁移体的扫描电镜图；图8为迁移体的透射电镜图，其中A为2μm标尺下的投射电镜图，B为0.5μm标尺下的投射电镜图；图9为蛋白免疫印迹法分析密度梯度离心后各组分Integrin α5、NDST1、PIGK、Tsg 101和Alix的表达情况结果图；图10为迁移体模型表征结果图，图10中Aa为密度梯度离心法富集迁移体的扫描电镜图，Ab为磁性适配体探针所富集迁移体的扫描电镜图；Ba为密度梯度离心法富集迁移体的透射电镜图，Bb为磁性适配体探针所富集迁移体的透射电镜图；图11为免疫印迹法分析细胞外囊泡标志蛋白的表达情况结果图；图12为记录MCP磁分离过程的情本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磁性适配体探针，其特征在于：包括骨架和修饰在骨架表面的适配体Apt_B3，所述骨架为Fe3O4纳米粒子，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的磁性适配体探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在Fe3O4纳米粒子表面修饰SiO2层、氨基层和中性亲和素蛋白，得到Fe3O4@SiO2‑
NA纳米粒子；在适配体Apt_B3的5
’
端修饰生物素，得到Biotin
‑
Apt_B3，所述适配体Apt_B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；将Biotin
‑
Apt_B3粉末与水混合，然后依次进行热处理和低温处理，得到Biotin
‑
Apt_B3水溶液；将Biotin
‑
Apt_B3水溶液和Fe3O4@SiO2‑
NA纳米粒子混合，孵育20~40分钟，得到所述磁性适配体探针。3.根据权利要求2所述的磁性适配体探针的制备方法，其特征在于，所述热处理的温度为90~100℃，所述热处理的时间为3~8分钟。4.根据权利要求2所述的磁性适配体探针的制备方法，其特征在于，所述低温处理的温度为
‑
5~5℃，所述低温处理的时间为5~15分钟。5.根据权利要求2所述的磁性适配体探针的制备方法，其特征在于，所述Biotin
‑
Apt_B3...

【专利技术属性】
技术研发人员：应斌武，徐一心，吴尧，易强英，焦琳，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：