一株过表达PGM的桑黄基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株过表达磷酸葡糖变位酶基因PGM的桑黄工程菌株及其构建方法与应用，所述的桑黄工程菌株由原始桑黄菌株的PGM基因过表达后改造得到。由于原始菌株在液体发酵中生产多糖的能力仍然有限，目前主要是通过传统发酵优化的手段提升产能，但已经难以得到较明显提升。因此，本发明专利技术通过分子手段进行改造，改造后的过表达PGM的基因工程菌相较于原始菌株糖的利用速率加快，菌丝生长速度加快，使得其发酵周期进一步缩短，同时提高了产物多糖产率。其中胞外多糖提升了25.6％，胞内多糖提升了11.8％，生物量提升了13.4％。生物量提升了13.4％。生物量提升了13.4％。

【技术实现步骤摘要】
一株过表达PGM的桑黄基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程及微生物
，具体涉及一株过表达PGM基因的桑黄基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]桑黄是一种珍贵的食药用菌，有“森林黄金”之美称。桑黄作为我国传统的中药材，最早记载于《神农百草经》和李时珍的《本草纲目》，主要用于止泻、崩漏带下、脾虚泄泻，此外还能利五脏、排毒、活血。有研究统计，桑黄的药理学功能有20多种，包括抑菌、消炎、抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫、保肝护肝、降血糖、降血脂、抗肺炎。随着研究的深入，其在抗肿瘤的方面的显著成效被人们所认知，有研究发现，桑黄多糖能促使肿瘤细胞自我毁灭，防止肿瘤细胞附着于体内并抑制转移，抑制率可高达96.78％，是目前国际所公认的抗癌天然产品中最有效的一种天然药用真菌，已经成为国内外医药制剂与保健品行业研究与开发的热点。
[0003]但随着桑黄的医药价值被发现，使得桑黄的市场需求逐渐上升。目前桑黄的来源方式主要有3种：野生、人工栽培和菌丝体。野生的桑黄成型出菇大概需要3
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5年，才能具有较好的医疗的价值，其生长周期过于长，难以供应市场需求。其次，目前人工栽培桑黄已经初具小规模，其周期约60d左右，但人工栽培所受限制因素较多，其出菇产量不稳定，其产量提升有限，只能缓解一定程度的市场需求。桑黄的液体发酵目前仍处于刚起步的阶段，目前处于初步建立桑黄发酵体系，其发酵周期约为7
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10d左右，大大缩短了桑黄的生长的周期，能够有限的缓解市场需求。但是液体发酵虽然缩短了生长周期，但其活性物质含量略有下降。同时目前桑黄和其他大型食用真菌的分子改造基础仍然处于起步阶段。因此本专利技术拟通过分子手段去增强桑黄发酵产多糖的发酵能力和发酵效率。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株过表达PGM基因的桑黄基因工程菌。
[0005]本专利技术还要解决的问题是提供上述桑黄基因工程菌的构建方法。
[0006]本专利技术最后要解决的问题提供上述桑黄基因工程菌在发酵产多糖中的应用。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术公开了一株桑黄基因工程菌株，即在桑黄菌株Sanghuangporus vaniniii中过表达了磷酸葡糖变位酶基因PGM。
[0009]其中，所述桑黄菌株Sanghuangporus vaninii来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，菌株编号为5.891。
[0010]其中，所述的磷酸葡糖变位酶基因PGM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]本专利技术进一步提出了上述桑黄基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0012](1)以桑黄菌株Sanghuangporus vaninii基因组DNA为模板，扩增出PGM目的基因
片段；
[0013](2)以质粒pAN7
‑
1为模板，扩增得到启动子gpdA片段；
[0014](3)利用限制性内切酶获得线性化质粒pAN7
‑
1，将步骤(1)获得的PGM基因片段与步骤(2)获得的gpdA片段纯化后再与线性化质粒pAN7
‑
1连接，并导入大肠杆菌DH5α中，获得DH5α
‑
pAN7
‑1‑
PGM，提取所获得的目标大肠杆菌的质粒并验证；
[0015](4)将步骤(3)得到的质粒转化至利用桑黄菌株Sanghuangporus vaninii制备得到的原生质体中，即得过表达桑黄基因工程菌株。
[0016]其中，步骤(1)中，所述的扩增PGM目的片段，所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
[0017]其中，步骤(2)中，所述的扩增启动子gpdA片段，所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
[0018]其中，步骤(3)中，所述的限制性核酸内切酶为HindⅢ，利用限制性核酸内切酶对获得的质粒进行酶切验证。
[0019]其中，步骤(3)中，所述的重组大肠杆菌为DH 5α
‑
pAN7
‑1‑
PGM，利用凝胶电泳对重组大肠杆菌中提取得的质粒进行可视化初筛。
[0020]其中，步骤(4)中，利用含有15
‑
30μg/mL潮霉素抗性的PDA培养基筛选获得阳性转化子，得到过表达PGM基因的桑黄基因工程菌株。
[0021]上述桑黄基因工程菌株在液体发酵产桑黄多糖中的应用也在本专利技术所保护的范围之内。
[0022]其中，所述的桑黄基因工程菌的种子液按照5％
‑
20％的体积比接种于发酵培养基中；优选为按照10％的体积比。
[0023]其中，所述的发酵，其发酵条件为：发酵温度20
‑
30℃，发酵的时间为7
‑
10d。优选的发酵条件为：发酵温度26℃，发酵的时间为8
‑
9d，当发酵残糖浓度低于5g/L时，发酵结束。
[0024]其中，所述的发酵，其发酵培养基配方如下：30
‑
70g/L黄豆粉、30
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70g/L葡萄糖、0.1
‑
5g/L磷酸二氢钾、3
‑
10g/L酵母膏、0.1
‑
5g/L七水合硫酸镁、0.01
‑
0.1g/L VB1，溶剂为水。优选的，发酵培养基配方如下：30g/L黄豆粉、30g/L葡萄糖、0.5g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、1g/L七水合硫酸镁、0.01g/L VB1，溶剂为水。
[0025]其中，所述的多糖为胞外多糖EPS和/或胞内多糖IPS，具体利用硫酸苯酚法测定多糖浓度。
[0026]从发酵结果可以看出，过表达PGM的基因工程菌株相较于原始菌株的耗糖速率加快，糖的利用能力增强，发酵周期由9d缩短到8d，缩短了约1d。过表达PGM的基因工程菌株的多糖合成能力明显高于原始菌株WT，胞内多糖IPS产量从1.02g/L提高到1.14g/L，提升了约11.8％，胞外多糖EPS从2.58g/L提升到了3.24g/L，提升了约25.6％，生物量DW从15.7g/L提升到了17.8g/L，提升了约13.4％。由此可见，基因pgm的过表达促进了菌体对糖的利用速率，促进了桑黄菌株的生长和桑黄多糖的合成。
[0027]有益效果：由于原始菌株在液体发酵中桑黄多糖的产量只能有限的缓解市场需求，因此本专利技术通过分子手段，构建了一株过表达PGM基因的桑黄基因工程菌株，与原始菌株相比，PGM基因的桑黄基因工程菌株对糖的利用速度加快，菌丝生长速度加快，缩短了发酵周期的同时，也提高了桑黄多糖的产量。
附图说明
[0028]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做更进一步的具体说明，本专利技术的上述和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株过表达基因PGM的桑黄基因工程菌，其特征在于，在桑黄菌株Sanghuangporus vaniniii中过表达了磷酸葡糖变位酶基因PGM。2.根据权利要求1所述的桑黄基因工程菌，其特征在于，所述的桑黄菌株Sanghuangporus vaniniii来源于CGMCC，菌株编号为5.891。3.根据权利要求1所述的桑黄基因工程菌，其特征在于，所述的磷酸葡糖变位酶基因PGM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.权利要求1
‑
3中任意一项所述的桑黄基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以桑黄菌株Sanghuangporus vaninii基因组为模板，扩增出PGM目的片段；(2)以质粒pAN7
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1为模板，扩增得到启动子gpdA片段；(3)利用限制性内切酶获得线性化质粒pAN7
‑
1，将步骤(1)获得的PGM片段与步骤(2)获得的gpdA片段纯化后再与线性化质粒pAN7
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1连接，并导入大肠杆菌DH 5α中，获得重组大肠杆菌，提取所获得的重组大肠杆菌的质粒并验证；(4)将步骤(3)得到的质粒转化至利用桑黄菌株Sanghuangporus vaninii制备得到的原生质体中，即得到过表达桑黄基因工程菌株。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，姚建忠，应汉杰，余斌，韩辉，刘静，王勇，孙文俊，陈天鹏，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：