CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用制造技术

本发明专利技术涉及细胞生物技术领域，尤其涉及CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用。该应用以CAPN8的表达变化进行中心粒细胞膜完整性评价，评价的时效性早于染料类方法，且重复性良好，对早期评价病理生理条件下的炎症和组织损伤具有重要意义。件下的炎症和组织损伤具有重要意义。件下的炎症和组织损伤具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用


[0001]本专利技术涉及细胞生物
，尤其涉及CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用。

技术介绍

[0002]生物体内许多代谢过程都与膜功能有关，细胞膜组分的正常和结构的稳定是其发挥生理功能的前提，细胞膜依据其磷脂双分子层上镶嵌各种糖蛋白和膜蛋白，具有一定的流动性和选择透过性，在生物体内主要发挥信息交流和物质交换的功能。然而，某些理化因素或生物学因素可导致细胞膜破坏，失去控制物质进出功能，影响细胞内环境的平衡。因此，维持细胞膜的完整性是细胞生存和发挥生理功能的基础。
[0003]细胞膜发生损伤的同时，细胞亦可立即启动膜损伤修复的应急反应，以修补受破坏的膜结构，参与这个过程的蛋白分子即细胞膜损伤修复相关分子。目前，研究认为钙离子(Ca
2+
)急剧内流是细胞膜损伤后修复的启动因子，细胞膜上的Ca
2+
敏感结构域会对细胞内Ca
2+
的突然升高迅速反应。如果损伤不严重，可以通过以下三方面过程进行修复：使用胞内细胞器(特别是溶酶体)的膜修补受损膜，细胞器移动到受损膜并与受损膜融合；由小泡蛋白介导的受损膜的内吞作用；依赖于转运所需的内体分选复合物(ESCRT)的过程中受损膜的胞吐。
[0004]因此，理论上，可以通过细胞存储的细胞膜损伤后修复相关的分子含量或损伤发生后应急反应过程中产生的修复相关的分子的转录产物水平来评价细胞膜继续保持完整性的能力。但是，就我们查阅相关资料所知，只存在一些细胞膜完整性的检测装置或通过细胞膜非通透性核酸染料来检测细胞膜是否完整，还未有利用一种细胞膜相关的分子来评价细胞膜完整性的良好方法；而一旦将研究获得的该类分子用于评价细胞完整性，也将对医学实际诊疗工作中因细胞膜破裂、死亡所导致的炎症感染等疾病的辅助诊治具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术中存在的空缺，提供了CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用，该应用以CAPN8的表达变化评价中心粒细胞膜完整性，可以根据量化的实验结果，准确评价细胞膜完整性，时效性早于染料类方法，适用于革兰阴性菌，且重复性良好，对早期评价病理生理条件下的炎症和组织损伤具有重要意义，解决了现有技术中存在的问题。
[0006]本专利技术所采用的技术方案是：
[0007]提供了CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用。
[0008]进一步地，上述应用为CAPN8作为生物标志物非诊断目的的评价中性粒细胞膜完整性的方法。
[0009]进一步地，本专利技术还提供了CAPN8作为生物标志物在制备评价中性粒细胞膜完整
性的试剂或试剂盒产品中的应用。所述试剂盒包括：感染信号，在mRNA水平、和/或蛋白水平检测CAPN8的表达量的试剂。
[0010]进一步地，通过对中性粒细胞在mRNA水平、和/或蛋白水平检测CAPN8的表达，根据其相对表达量评价细胞膜完整性。
[0011]进一步地，上述应用是将中性粒细胞在刺激信号感染0h的膜相关蛋白CAPN8的相对表达量设为1，计算刺激信号感染一定时间后的膜相关蛋白CAPN8的相对表达量，大于1，表明分子表达量升高，细胞膜完整；小于1，表明分子表达量较低或没有表达该分子，细胞膜不完整。
[0012]进一步地，刺激信号选择幽门螺杆菌、脂多糖或大肠埃希菌；感染时间选择2h。
[0013]进一步地，上述应用评价中性粒细胞膜完整性采用如下方法的操作步骤：
[0014](1)建立感染体系
[0015]选取中性粒细胞提取试剂盒分离得到人外周血中性粒细胞，在37℃，5％CO2条件下，将幽门螺杆菌、脂多糖或大肠埃希菌加入装有悬浮中性粒细胞的培养皿内，得到细菌感染的中性粒细胞体系；其中，细胞浓度为1.0
×
106个/mL，中性粒细胞与幽门螺杆菌浓度比为1:10，中性粒细胞与大肠埃希菌浓度比为1:1，脂多糖用量为1.0μg/mL；
[0016](2)步骤(1)的感染体系建立后，分别收集感染发生后0h、2h、4h和12h的细胞，加入异硫氰酸胍和苯酚，破碎裂解细胞；提取RNA、逆转录和实时荧光定量PCR实验，计算细胞内CAPN8的相对转录水平(以β
‑
actin为内参)；
[0017](3)根据所测RNA浓度，以提取的RNA为模板进行逆转录合成cDNA，设计CAPN8信号分子引物，进行实时荧光定量PCR反应，根据所得Ct值，计算2
‑△△
Ct
，得到目的基因相对转录量；获得细胞完整性与否的评价结果。
[0018]进一步地，步骤(2)具体步骤为：
[0019]①
将培养皿内的细胞悬液收集于15mL离心管中，300g离心5min收集细胞；加入1mL无菌PBS洗涤细胞并转移悬液至新的Ep管中，300g离心5min，弃掉上清，随后加入1.0mL异硫氰酸胍和苯酚混合物，反复吹打，破碎裂解细胞；
[0020]②
室温静置5min，加入等体积饱和酚溶液，上下颠倒混匀6
‑
8次，置冰上15min，12000g，4℃离心15min；
[0021]③
上清转移至新的Ep管中，加入等体积异丙醇，充分混匀后置于冰上静置10min，12000g，4℃离心10min；
[0022]④
弃上清，75％乙醇溶液洗涤沉淀一次，12000g，4℃离心5min；
[0023]⑤
弃上清，静置10min左右，使残余乙醇充分挥发，用适量DEPC水溶解沉淀，随后利用超微量分光光度计分析所得RNA纯度的浓度，
‑
80℃保存，用于后续实验。
[0024]进一步地，步骤(3)计算2
‑△△
Ct
后，采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，每组实验至少重复3次，计量资料数据两组间均值比较正态分布采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
[0025]本专利技术的有益效果：
[0026](1)本专利技术应用采用对中性粒细胞在mRNA水平检测CAPN8的表达，根据其表达变化判断中性粒细胞完整性与否，进而可对早期评价病理生理条件下的炎症和组织损伤具有重要意义。具体通过不同感染信号刺激中性粒细胞的实验方法进行了验证，通过将中性粒细
胞与感染信号建立体外共培养模式，在共培养2h后分别在mRNA水平检测CAPN8的表达情况，计算相对表达量，将培养0h设为1，实验组的相对表达量与0h相比，大于1，说明该分子表达量升高，提示细胞膜完整；小于1，说明该分子表达量较低或没有表达该分子，提示细胞膜不完整。
[0027](2)本专利技术应用的评价方法具备可靠性，重复性好。
附图说明
[0028]图1是Annexin V/PI双染法检测的幽门螺杆菌感染细胞凋亡及细胞膜通透性；
[0029本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过对中性粒细胞在mRNA水平、和/或蛋白水平检测CAPN8的表达，根据其相对表达量评价细胞膜完整性。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将中性粒细胞在刺激信号感染0h的膜相关蛋白CAPN8的相对表达量设为1，计算刺激信号感染一定时间后的膜相关蛋白CAPN8的相对表达量，大于1，表明分子表达量升高，细胞膜完整；小于1，表明分子表达量较低或没有表达该分子，细胞膜不完整。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，刺激信号选择幽门螺杆菌、脂多糖或大肠埃希菌；感染时间选择2h。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，评价中性粒细胞膜完整性采用如下方法的操作步骤：(1)建立感染体系选取中性粒细胞提取试剂盒分离得到人外周血中性粒细胞，在37℃，5％CO2条件下，将幽门螺杆菌、脂多糖或大肠埃希菌加入装有悬浮中性粒细胞的培养皿内，得到细菌感染的中性粒细胞体系；其中，细胞浓度为1.0
×
106个/mL，中性粒细胞与幽门螺杆菌浓度比为1:10，中性粒细胞与大肠埃希菌浓度比为1:1，脂多糖用量为1.0μg/mL；(2)步骤(1)的感染体系建立后，分别收集感染发生后0h、2h、4h和12h的细胞，加入异硫氰酸胍和苯酚，破碎裂解细胞；提取RNA、逆转录和实时荧光定量PCR实验，计算细胞内CAPN8的相对转录水平(以β
‑
actin为内参)；(3)根据所测RNA浓度，以提取的RNA为模板进行逆转录合成cDNA，设计CA...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明义，刘鹏，王娜，张婧，卢德臣，
申请(专利权)人：威海市立医院，
类型：发明
国别省市：