用于表达LOC101905509ORF区的载体和应用制造技术

本发明专利技术属于基因生物工程技术领域，公开一种用于表达lncRNA LOC101905509ORF区的载体，所述载体是通过将6

【技术实现步骤摘要】
ORF区核酸序列组成，所述载体是通过将6
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His表达标签，3
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FLAG表达标签和LOC101905509的预测ORF区核酸序列串联连接在空载质粒pcDNA3.1
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HisB上获得的；
[0008]其中，LOC101905509的预测ORF区核酸序列为SEQ ID NO.1。
[0009]进一步地，所述载体的构建方法包括如下步骤：
[0010]依据多组学分析结果获得的LOC101905509的ORF核酸序列信息，体外合成末端带有Xho I和Xba I酶切位点以及6
×
His和3
×
FLAG表达标签的目标片段序列，目标片段序列为SEQ ID NO.2
[0011](CTCGAGGCCACCATGCATCATCACCATCACCATGACTACAAGGACGACGACGACAA GGATTACAAGGATGATGATGATAAGGACTATAAGGACGATGATGACAAGTTCTGGCCCAGACCCCAGTCTCCAGAACCTTGTCTGGAGGCGGCACGGGGTCTGCATGGCCTCTCACCCATGGACAGCTCCATCCAGCTGACCCAGGTACCAGCTGTCCCCCATGAGCCATGCTTCTGGAGCCTCAGGGTGGTGAGCAGGGGACTTGCAGCTCCCTGGCCAGAAACCCTTTACCTGGGCATCACCCCAGCTCCTACTGATGCCCACGGACATAGTAAGGAGGCCAGCAGGTGGGGAGTGGGACTTCCTGCCCAACGTGGAGCGTGTCTGCACCATCCCCCTGCCCGCCAGGGCCACAGTCTCCTTCTTGGCTGCAGATCATGGCCTCCATGGGGCCTCTGCCCCAAGGCTCCCTCCTTACCTGCACTCACAGGCATAGTACCCTCACCTTTGCCCAGCCGCACGGACTGGGCTGCAGGGGGCGGGACAGCTGCCGTGGAATTCGTCATCAGGGAAACCAAAGGCACACAGAGCAGACAGTGATCTAGA)，将LOC101905509 ORF区的体外合成片段与pcDNA3.1
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hisB空载质粒进行连接，获得融合蛋白载体。
[0012]进一步地，所述载体的构建方法还包括如下步骤：
[0013]获得的体外表达产物，并用qRT
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PCR和Western blot的方法验证其表达情况。
[0014]如上所述的载体在证实非编码RNALOC101905509具有编码潜能方面中应用。
[0015]如上所述的载体在表达融合蛋白方面中的应用。
[0016]如上所述的载体在编码功能性微肽方面中的应用。
[0017]本专利技术取得的有益效果是：
[0018]1、本专利技术利用lncRNALOC101905509的体外表达载体
[0019]pcDNA3.1
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HisB
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LOC101905509，获得LOC101905509体外表达产物，通过验证产物的表达水平，说明非编码RNALOC101905509具有编码潜能，能编码产生微肽。
[0020]2、利用本专利技术建立的融合蛋白载体pcDNA3.1
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hisB
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LOC101905509，为后续开展更为深入的LOC101905509功能探究提供材料和夯实基础，同时也为深入筛选验证具有编码产物的lncRNA提供技术支持和佐证材料。
[0021]3、本专利技术通过对LOC101905509具备潜在编码潜能的ORF区进行序列扩增并构建体外表达载体，然后采用lip 3000试剂转染牛骨骼肌卫星细胞和293T细胞，检测在多种细胞水平上融和蛋白的mRNA和蛋白的表达情况。
[0022]4、本专利技术针对过去认为lncRNA没有生物学功能的论点，提供一种lncRNA LOC101905509的体外表达载体pcDNA3.1
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HisB
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LOC101905509，利用该融合蛋白载体，获得LOC101905509的体外表达产物并验证其表达情况，可以发现被定义为非编码RNA的LOC101905509是具有编码能力的，并且可以编码微肽，为后续探索LOC101905509生物学功能的实验研究夯实基础、提供新的思路和参考。
[0023]5、本专利技术根据LOC101905509 ORF区碱基序列，设计合成出目的片段，通过添加酶切位点Xho1及Xba1，将目的片段、6
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His和3
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FLAG表达标签序列连接至pcDNA3.1
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HisB表
达载体上，之后通过转染入牛骨骼肌卫星细胞与293T细胞中分别验证其体外表达情况，证实目的片段具有编码微肽蛋白的能力。本专利技术所构建载体的具体用途在于证实非编码RNA的LOC101905509具有编码潜能，能够编码功能性微肽，其表达或对牛肌细胞的增殖和分化过程具有调控作用，为后续进一步探索LOC101905509生物学功能的实验研究夯实基础、提供新的思路和参考。同时为肌肉相关性研究提供实际应用价值。
[0024]6、在前期的研究中，本专利技术人对牛骨骼肌卫星细胞进行了转录组学、翻译组学及微肽组学三个组学的测序分析，经过多组学联合分析发现lncRNALOC101905509具有小的开放阅读框(sORF)结构，并在微肽组学中发现与之预测氨基酸序列对应的微肽产物，因此，初步判断LOC101905509可能具有编码能力，可以编码产生功能性微肽。鉴于此，我们设计扩增了牛LOC101905509基因ORF区的编码序列，构建了融合蛋白载体pcDNA3.1
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hisB
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LOC101905509，把重组质粒转染至293T细胞，检测其外源表达情况，为后续开展更为深入的LOC101905509功能探究提供材料和夯实基础，同时也为深入筛选验证具有编码产物的lncRNA提供技术支持和佐证材料。
[0025]7、本申请人通过前期的多组学研究筛选获得一条可能与肌肉发育相关并且具有编码潜能的lncRNA，LOC101905509，将其能编码功能性微肽的ORF区序列与表达标签串联，成功构建可以直接检测的LOC101905509编码微肽外源性表达载体，为后续该功能性微肽的研究和应用奠定基础。
附图说明
[0026]图1为本专利技术中LOC101905509融合蛋白的重组核酸序列模式图；
[0027]图2为本专利技术中pcDNA3.1
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HisB
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101905509重组质粒单酶切结果图；
[0028]图3为本专利技术中pcDNA3.1
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HisB
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loc101905509载体测序结果结果图；
[0029本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于表达lncRNALOC101905509ORF区的载体，其特征在于：所述载体的核心表达原件由广谱强启动子CMV，T7启动子，6
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His表达标签，3
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FLAG表达标签和lncRNALOC101905509ORF区核酸序列组成，所述载体是通过将6
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His表达标签，3
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FLAG表达标签和LOC101905509的预测ORF区核酸序列串联连接在空载质粒pcDNA3.1
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HisB上获得的；其中，LOC101905509的预测ORF区核酸序列为SEQ ID NO.1。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述载体的构建方法包括如下步骤：依据多组学分析结果获得的LOC101905509的ORF核酸序列信息，体外合成末端带有Xho I和Xba I酶切位点以及6
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His和3
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FLAG表达标签的目标片段序列，目标片段序列为SEQ ID NO.2(CTCGAGGCCACCATGCATCATCACCATCACCATGACTACAAGGACGACGACGACAAGGATTACAAGGATGATGATGATAAGGACTATAAGGACGATGATGACAAGTTCTGGCCCAGACCCCAGTCTCCAGAACCTTGTCTGGAGGCGGCACGGGGTCTGCATGGCCTCTCACCCATGGACAGCTCCATCCAGCTGACCCAGGTAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新，罗锦堂，胡德宝，郭益文，张林林，丁向彬，郭宏，宋昕宇，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：